论文摘要
随着人口老龄化,帕金森病的发病率不断升高,而L-Dopa作为治疗帕金森病的最主要药物,市场需求也随之不断的增加。酪氨酸酶是一种二酚酶,催化L-酪氨酸合成L-Dopa及L-Dopa生成黑色素。分离自南极海洋的极地寡营养细菌AT52具有产生多巴和黑色素的能力,且控制这一过程的关键酶亦为酪氨酸酶。本课题通过研究AT52菌的性质、培养条件、发酵液中多巴的提取方法和酪氨酸酶的分离纯化工艺,为L-Dopa和酪氨酸酶提供了新的来源。主要研究结果如下：1.AT52菌的形态结构AT52 （Alteromonas stellipolaris sp. nov.）菌属革兰氏阴性菌,可在寡营养条件下不依赖于维生素生长。在富营养条件下AT52菌体细胞由一层原生质膜包裹,周身附肢且附肢长短不一,具鞭毛,出芽生殖。寡营养饥饿生存的菌体细胞相对较小,近球形,边缘凹凸不平,无鞭毛附肢等超微结构,细胞休眠,无出芽生殖过程。2.AT52菌液态富营养的最佳培养条件AT52菌在富营养条件下的最佳生长条件为：1L南极陈海水中加入蛋白胨5g,酵母粉1g,调pH值至8.0,培养温度12℃,转速为180 r/min,装液量为500mL三角瓶中装200 mL,通氧量充分。3.AT52菌中L-Dopa提取工艺及对L-Dopa产量的影响因素无机盐类、糖类、氮源物质、氨基酸和维生素类物质对L-Dopa的产量无影响,在加入0.1 g/L的底物时,多巴的产量有所提高。AT52菌发酵液中L-Dopa的产率为1.3 g/L,采用乙酸乙酯和活性碳相结合的方法可提取得到L-Dopa纯品,最终L-Dopa得率为41.75%。4.酪氨酸酶的分离纯化纯化AT52菌中的酪氨酸酶采用先通过硫酸铵饱和度为0%-40%除杂,收集硫酸铵饱和度为40%-70%的沉淀。再采用DEAE-SepharoseTM Fast Flow柱层析进行分步洗脱,洗脱速度为3 mL/min,洗脱液分别为400、400-450和1000 mmol/L的NaCl,缓冲液为20 mmol/L的Tris-HCl（pH=7.5）溶液,收集400-450 mmol/L的NaCl洗脱峰。最后采用Sephadex G-150柱层析,洗脱速度为0.3 mL/min,洗脱液为150mmol/LNaCl,缓冲液为20 mmol/L的Tris-HCl （pH=7.5）溶液,收集第二个洗脱峰。通过硫酸铵沉淀、DEAE-SepharoseTM Fast Flow层析和SephadexG-150层析后,得到电泳纯的酪氨酸酶。5.酪氨酸酶性质的初步研究AT52菌中酪氨酸酶的分子量约为29 kDa,最适pH值为8.0,最适温度为40℃,其N端序列为Met-Thr-Val-Phe-Asp-Asp-Asn-Ser-Leu-Ser-Ile-Gly。加入EDTA对酶的活性有抑制作用。而Cu2+对酪氨酸酶活性的影响与其浓度有关,低浓度时激活,当浓度为0.4 mmol/L时激活作用最强,当浓度大于0.6 mmol/L时则产生抑制作用。
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相关论文文献
- [1].极地寡营养细菌AT52(Alteromonas stellipolaris sp.nov.)超微结构、生长生理特性及液态富营养发酵培养条件优化[J]. 极地研究 2011(03)