AtMCT转基因烟草的培育

论文摘要

卤代甲烷的生物合成机制已经被发现,由以下酶促反应完成:SAM （S-adenosyl methiomine） +XCl-, Br-, I-→CH3X+SAH（S-adenosyl homocysteine）,反应由一种甲基转移酶（Methyl Chloride Transferase,MCT）催化完成。模式生物——拟南芥也产生和释放卤代甲烷,行使此功能的主要的酶是由HOL（HARMLESS TO OZONE LAYER）基因编码的,该酶属于甲基转移酶家族,能催化依赖SAM的Cl-、Br-、I-的甲基化。线虫是引起植物侵染性病害的四大病原之一,根结线虫更是一种分布广范、严重危害农作物的植物内寄生线虫。目前,对线虫的防治主要以药物（如甲基溴）防治为主,其它防治为辅助手段。甲基溴（CH3Br）一直是作为熏蒸杀虫剂被广泛应用,它可以杀死真菌、细菌、土壤携带的病毒、昆虫、蛾、线虫和啮齿动物。但甲基溴同时也是一种剧毒农药,如使用不当,会造成人畜伤害和土壤污染。此外,甲基溴由于会对臭氧层造成破坏,国际组织呼吁尽快淘汰甲基溴。因此,培育出抗病品种是最经济的方法,成为当务之急。本研究以分子生物学和基因工程研究的模式植物——烟草为实验材料,通过农杆菌介导法用含有抗卡那霉素的nptll基因的双元载体将过量表达基因AtMCT导入烟草叶片外植体中,然后在含有卡那霉素的选择培养基上进行筛选培养。对获得的转基因植株进行了PCR检测、Southern和Western杂交鉴定,借以初步探讨过量表达基因AtMCT在植物中的转化和表达情况,是否使转基因烟草能微量、持续产生甲基溴,当病源物侵染时可直接对其作用,从而替代甲基溴土壤熏蒸杀虫剂的作用,为其今后在更多的植物上应用提供依据。同时,本研究把甲基卤化物转移酶基因转化到烟草中,通过加强盐离子代谢,有望提高烟草的钾离子含量,促进光合产物的运输,促进蛋白质和糖类的合成,从而探讨其对改良转基因烟草品质的影响。此技术在国内外首创。本实验结果如下:1)通过直接转化法将At-MCT基因过量表达载体导入农杆菌EHA105,用50mg/L的Kan作为筛选压,获得的阳性克隆用PCR方法进行验证,获得了和阳性对照一致大小的约750bp条带。2)建立了NC89烟草的遗传转化体系:a)实验中采用无菌苗烟草叶片为外植体,以MS为基本培养基,筛选出适于烟草NC89诱导分化的培养基:MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.15mg/L培养基,并于MS生根培养基上获得完整再生植株。b)烟草品种NC89对卡那霉素不敏感,100 mg/L的卡那霉素作为烟草叶片转化受体的筛选浓度比较适宜。c)在选择培养中加入500 mg/L的头孢霉素能有效抑菌,且不影响外植体的分化,转化率为83.1%。d)对于长到46片叶的烟草无菌苗,农杆菌浸染时重悬菌液浓度以OD600=0.50.8为宜,长芽的外植体转化率可达96%以上。e)农杆菌的浸染时间对烟草外植体有很大的影响,烟草的浸染时间以68 min为好。f)共培养实验表明,共培养2天是烟草的最佳培养时间,超过3天在以后的培养中无论是水洗还是加大抗菌素的浓度都不能有效抑制农杆菌的生长。3)转化植株的获得:将农杆菌浸染叶盘共培养2天后,转接到筛选诱导培养基上培养,部分愈伤组织白化,具有Kan抗性的愈伤正常生长,2周后就开始出现淡绿色愈伤组织和芽点,最后分化出少量不定芽。转接到含有100mg/L Kan和500mg/L Cef的抗性芽继代培养基上继续筛选。当抗性芽生长至23cm时,置于生根培养基上进行根的诱导,共获得18个AtMCT转化株系,且抗性植株均正常生长。4)转基因植株的分子鉴定:a)为进一步鉴定转基因植株的可靠性,提取卡那霉素抗性植株的叶片总DNA,利用基因的特异引物进行PCR检测,均能扩增出750bp的特异性目的条带,初步表明AtMCT外源基因已整合到受体植物基因组中。b)用CTAB法大量提取烟草叶片的基因组DNA,以野生型植株的DNA作对照,用EcoRI酶切后进行Southern印迹,以AtMCT基因的全长为探针进行转基因烟草的Southern杂交分析。Southern杂交结果进一步证实外源基因已整合到烟草的基因组中。c)提取部分转基因植株的可溶性蛋白,用通过树脂层析纯化的在大肠杆菌BL21（DE3）中表达的AtMCT融合蛋白制备的抗体进行Western杂交:转基因植株均有杂交信号,野生型植株没有杂交信号,表明目的基因在转基因植株中随基因组一起被转录并翻译。以上试验结果表明,AtMCT转基因烟草的培育成功。

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中文摘要

Abstract

英文缩略表

第一部分综述

一植物基因工程的现状和发展趋势

1.1 植物基因工程的现状

1.2 植物基因工程的发展趋势

1.3 烟草基因工程的研究进展和意义

1.3.1 抗性基因工程的研究

1.3.2 品质改良基因工程的研究

1.3.3 生物反应器系统基因工程的研究

二根癌农杆菌Ti 质粒介导的遗传转化机制

2.1 根癌农杆菌的生物学特性

2.2 根癌农杆菌的内共生原理

2.3 根癌农杆菌转化的优点

2.4 影响转化效率的因素

三卤代甲烷（MeX）酶促机制的研究

3.1 卤代甲烷（CH3X）的自然源研究

3.2 卤代甲烷的生物产生机制

3.3 模式植物拟南芥的HOL 基因

3.4 酶促机制产生卤代甲烷对植物的生物学意义

四线虫

五本文的立题依据及目的意义

第二部分实验论文

一实验材料及实验方法

1 实验材料

1.1 植物材料

1.2 菌株及质粒

1.3 酶及化学试剂

1.4 主要仪器设备

1.5 培养基

1.6 植物激素和抗生素的配制

1.7 质粒提取液

1.8 引物序列

2 实验方法

2.1 质粒的提取

2.2 大肠杆菌感受态的制备及转化

2.3 GeneClean 法从琼脂糖凝胶上回收DNA 片段

2.4 农杆菌感受态的制备及转化

2.5 烟草NC89 遗传转化

2.5.1 无菌苗的获得

2.5.2 烟草高频再生体系的建立

2.5.3 根癌农杆菌的转化前培养

2.5.4 转化

2.6 转基因植株的PCR 检测

2.6.1 CTAB 法微量提取基因组DNA

2.6.2 琼脂糖凝胶电泳检测烟草总DNA

2.6.3 PCR 检测

2.7 植物基因组DNA 的提取及Southern 杂交膜的制备

2.7.1 CTAB 法大量提取植物基因组DNA

2.7.2 Southern 杂交膜的制备

2.8 Southern 杂交分析

2.8.1 cDNA 探针的制备

2.8.2 杂交过程

2.8.3 洗膜及显影

2.9 Western 杂交分析

2.9.1 烟草可溶性蛋白的提取

2.9.2 SDS-PAGE

2.9.3 转膜

2.9.4 Western 检测

二实验结果与分析

1 植物表达载体的验证

2 NC89 烟草遗传转化体系的建立

2.1 烟草叶片分化培养基中激素浓度的确定

2.2 选择培养中抑菌抗生素浓度的确定

2.3 选择压的确定

2.4 预培养时间

2.5 浸染用农杆菌的浓度和浸染时间

2.6 共培养时间

2.7 转化植株的获得

3 转基因植株的PCR 检测

3.1 CTAB 法提取的植株的DNA 检测

3.2 CTAB 法提取的植株DNA 的PCR 检测

4 转基因烟草的Southern 杂交分析

5 转基因烟草的Western 杂交分析

三讨论

图版

参考文献

硕士期间发表的论文

致谢

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