论文摘要
第一部分小鼠Cdk4-siRNA表达载体的构建和鉴定目的前期研究发现,细胞周期中Cdk4/cyclinD1-pRb-E2F1这一信号转导通路的异常激活在npc-/-小鼠神经元变性机制中发挥了一定的作用,侧脑室注射cdk4的特异性抑制剂flavopiridol,能明显减轻npc小鼠脑内的蛋白过度磷酸化和细胞骨架病变。本课题针对小鼠cdk4基因,应用慢病毒载体（ lentiviral vector）介导的RNAi效应,在体外和体内沉默（knockdown）Cdk4基因。在本部分研究中,构建3个针对小鼠Cdk4的pSilencer-1.0-U6-siRNA表达载体,转染HEK293细胞,筛选出沉默Cdk4基因的最佳序列,用以下一步构建慢病毒载体。方法（1）利用Ambion公司在线软件,设计3个针对小鼠Cdk4基因的shRNA序列,化学合成含茎环结构的正义链与反义链,退火形成双链;（2）退火后的双链插入ApaⅠ和EcoRⅠ双酶切的Psilencer-1.0-U6-siRNA表达质粒,位于mouseU6启动子后。（3）酶切电泳和测序鉴定3个重组质粒;（4）将Psilencer-1.0-U6空载体和3个重组质粒瞬时转染HEK293细胞,72小时后Western blotting检测各实验组Cdk4的表达水平,筛选出RNAi效果最显著的质粒。结果（1）经酶切鉴定及DNA测序,3个重组质粒中正确插入了目的基因片断;（2）瞬时转染Cdk4-siRNA的HEK293细胞, 72 h后,以Psilencer-1.0-U6- cdk4-siRNA2抑制Cdk4蛋白表达最为有效,其抑制率约为71%;结论:成功构建了针对Cdk4的RNAi表达载体Psilencer-1.0-U6-cdk4-siRNA1, Psilencer-1.0-U6-cdk4-siRNA2和Psilencer-1.0-U6-cdk4-siRNA3,其中Psilencer-1.0-U6- cdk4-siRNA2最有效抑制cdk4在HEK293中的表达,为将其进一步应用于Cdk4相关疾病的研究治疗奠定了基础。第二部分携带小鼠Cdk4-siRNA慢病毒载体的构建和体外研究目的有假说认为,神经变性病中Cdks介导的细胞骨架蛋白高度磷酸化是造成细胞骨架损害并最终导致神经元变性的关键性环节,Cdk4/CyclinD1-pRb-E2F1通路的异常激活包括其中。采用RNAi方式特异性地抑制Cdk4基因可能对神经变性病进行有效干预,而慢病毒载体可感染非周期性和有丝分裂后的细胞,并且表达的RNA干扰效应可在靶细胞内长期存在,因此本部分构建表达Cdk4-siRNA的慢病毒载体,在体外感染细胞检测它的基因沉默效果,为在体实验奠定基础。方法（1）合成筛选出的Cdk4-siRNA序列2和一对无义对照序列,正义链加BamHⅠ、反义链加EcoRⅠ酶切位点;（2）退火后的双链插入BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切的pSIH1-H1-copGFP shRNA表达载体;（3）利用载体多克隆位点两端的引物进行PCR扩增和测序鉴定阳性重组子;（4）将携带干扰序列和无义对照序列的穿梭质粒pSIH1-siRNA分别与慢病毒包装质粒共转染HEK293T细胞,生成慢病毒;（5）纯化、浓缩病毒液,测定滴度;（6）病毒感染BV-2细胞,部分传代,72小时后,计算感染率,RT-PCR并Western blotting检测Cdk4的表达水平。结果（1） PCR扩增重组载体得到278bp片段,而空载体则为217bp;测序证实Cdk4-shRNA和无义对照序列正确插入载体pSIH1-H1-copGFP;（2）携带干扰序列和无义对照序列的穿梭质粒pSIH1-siRNA与慢病毒包装质粒共转染HEK293T细胞后包装产生病毒;（3）浓缩病毒悬液后测定滴度,携带干扰序列的慢病毒为2 x 108ifu/ml,对照慢病毒为1x 108ifu/ml;（4）病毒感染BV-2细胞效率达90%,RT-PCR和Western blotting结果发现,携带干扰序列的慢病毒组较对照慢病毒组和空白细胞组,Cdk4在mRNA水平和蛋白表达水平均明显降低,后二者无明显差别。结论（1）成功构建pSIH1-Cdk4-siRNA和无义对照序列的表达载体;（2） shRNA表达载体和慢病毒包装质粒共转染HEK293T细胞后包装出高滴度病毒;（3）携带Cdk4-siRNA的慢病毒载体成功感染BV-2细胞,并特异性地沉默Cdk4基因的表达。第三部分携带Cdk4-siRNA的慢病毒对NPC小鼠神经变性的影响目的我们的前期研究发现,细胞周期依赖性蛋白激酶活性失调和细胞骨架蛋白过度磷酸化是C型Niemann-Pick病特征性病理表现。有学说认为,这些细胞骨架的改变最终导致了标志性细胞骨架损害如神经原纤维缠结和轴突球状体的形成。Npc-1基因自然突变的npc小鼠模拟了人类NPC的病理生理变化,即出现了与细胞骨架病理损害和神经元变性伴发的cdk5, cdc2和cdk4激活。我们发现,npc小鼠神经元Cdk4/cyclin D1水平明显上调,其生理性底物pRb磷酸化水平也显著增高,并参与病理性轴突球状体（axonal spheroids）的形成。因此,我们应用了这种动物模型和慢病毒介导的Cdk4基因沉默来明确Cdk4在npc小鼠的临床症状和病理损害形成中的作用。方法对病理改变尚处于初始阶段的4周龄npc小鼠给予Lentivirus-cdk4-siRNA侧脑室内注射,观察4周。采用免疫组化、免疫印记以及小鼠行为学评价等方法对小鼠的行为学及神经病理进行研究。结果4周后处死小鼠,Cdk4慢病毒组和对照病毒组小鼠脑的冰冻切片均可见EGFP的表达。初步发现Lentivirus-cdk4-siRNA可以减少SMI 31识别的磷酸化神经丝蛋白和MC6识别的磷酸化tau蛋白在npc小鼠脑部的表达,并在一定程度上改善了小鼠的运动功能和体重下降。结论经侧脑室注射慢病毒干预NPC小鼠的病理变化是有效的途径。初步发现携带cdk4-siRNA的慢病毒能够改善npc鼠的病理变化及运动功能。由于实验动物尚未达到预定数量,目前尚不足以得出非常肯定的结论。第四部分C型Niemann-Pick病神经原纤维缠结的形成与特征目的神经原纤维缠结（NFTs）是AD、C型尼曼-皮克病（NPC）、额颞叶痴呆和进行性核上性麻痹等多种神经系统变性疾病的核心病理标志之一。因其多见于老年患者,被普遍认为是一种与老龄化相关的脑部损伤性改变,但有研究发现NFT也存在于许多年轻的神经变性疾病患者脑内,本部分拟阐明NPC脑部NFTs形成的时相特征。方法以16位年龄从7个月至55岁不等的NPC病人为对象,采用tau和有丝分裂期相关抗体进行免疫组织化学染色和Bielschowsky银染及Western Blotting分析患者脑内NFT形成的特点。结果最早可在4岁患者的海马旁回发现典型NFT形成,随年龄增长数量逐渐增多。在形态上与Alzheimer’s病（AD）所见高度相似,但未发现老年斑。有趣的是在NPC中,有丝分裂期磷酸化表位早于tau蛋白过度磷酸化及NFT形成。结论NFT形成并非老龄化过程的结果,且与老年斑的存在与否并无关联。Cdc2/CyclinB1可能是NFT形成的关键性早期事件,针对其活性的抑制剂对于早期干预NPC的NFT形成有重要意义。
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