药用植物三七三萜合成途径功能酶特征与植物三萜合成通路分子进化

论文摘要

三萜类物质是植物界一大类次生代谢产物,广泛分布于各种植物中。自然界中的菌类、蕨类、单子叶、双子叶植物和动物及海洋生物中皆有发现,尤以双子叶植物中分布最多,其中菊科、大戟科、楝科、卫矛科、茜草科、橄榄科、唇形科等植物中更为普遍,具有重要的生物学意义。药用植物中以五加科、豆科、桔梗科、远志科、伞形科、毛茛科三萜皂苷种类、含量十分丰富。三萜皂甙呈现结构多变性及生物活性的多样性,在植物中不仅可参与防御病原体和害虫的生理过程,而且具有广泛的药理作用。一些常用的中草药含丰富的三萜皂甙并作为这些中草药的主要有效成分。这些中草药植物中的皂甙有些具有抗肿瘤、抗病毒、降低胆固醇、提高机体免疫能力等多种生物活性,有些则对心血管系统以及神经系统有重要药理作用,均具有重要的药用商业价值。植物三萜皂苷主要通过MVA的合成,经异戊二烯途径生成鲨烯,2,3氧化鲨烯的环化,产生五环或四环三萜的骨架,再经历各种修饰如氧化、取代和糖苷化,受细胞色素P450依赖的单加氧酶、糖苷转移酶及其他酶的催化。随着模式植物拟南芥基因组、水稻基因组研究项目的完成,对植物的功能基因的注释日益增多,涉及植物三萜皂苷生物合成通路的各种酶基因克隆研究逐渐增加。三七（Panax notoginseng）为五加科人参属多年生草本植物,曾为广西特产药用植物之一。目前已从三七分离出20多种达玛烷型三萜皂苷,其中主要成分与人参一致。国内外对三七皂苷已作了广泛的药理研究,证实三七皂苷是三七的主要有效成分,具有很大的开发利用前景。本研究主要目的是对广西特产药用植物三七的三萜生物合成通路做较系统研究,对这一通路所涉及关键酶进行克隆分析,认识其基本特征,从而有利于对一些药用植物有效成分三萜生物合成进行调控,促进三萜有效成分的合成与积累;另一方面通过对植物三萜生物合成通路酶分子聚类分析,从分子水平上为研究植物亲缘关系提供理论依据。本研究在已经获得的植物类异戊二烯及三萜生物合成功能酶基因信息的基础上,利用RT-PCR、3’-RACE及5’-RACE技术,从广西靖西县产的三七根中,克隆了FPS、SS、SE、CAS四个三萜生物合成途径中的关键酶基因cDNA,并得到完整的读码框架。上述基因cDNA序列均已登录NCBI的GenBank。本研究还构建了三七FPS、SE的原核表达载体pET32a（+）-FPS及pET32a（+）-SE,分别成功转化至大肠杆菌BL21（DE3）中。pET32a（+）-FPS能够在转化菌中,经IPTG进行有效的诱导表达,表达的重组蛋白分子量与预计的一致。比对分析表明,三七FPS、SS、SE、CAS读码框架推衍的氨基酸序列与人参相应基因推衍的氨基酸序列一致性分别为:FPS98.8%,SS 98.1%,SE 96.7%,CAS 90.1%。从中也可看出,同为五加科人参属植物的三七与人参在三萜生物合成途径中有关功能酶基因有高度同源性。而且随着30碳的鲨烯形成、氧化、环化,所需的酶分子逐渐增大,FPS有343个氨基酸,SS为415个氨基酸,SE为537个氨基酸,CAS为758个氨基酸。这可能是适应底物分子增大,结构变得更复杂的需要。三七三萜生物合成通路中的酶分子氨基酸序列与人参比对分析看出,越接近这一途径末端,差异也逐渐增加。以三七GAPDH为内参基因,通过克隆得到的三七GAPDH部分cDNA及三七SS基因全长cDNA片段序列构建的重组质粒为标准品,建立了三七SS基因转录表达的实时荧光定量PCR（Real-Time RT-PCR）技术,对一年生三七根、芦头、茎不同部位鲨烯合酶的转录表达进行了分析。同时,建立三七不同部位组织三萜总皂苷含量测定的方法,分别测定三七根、芦头、茎、叶的三萜总皂苷含量。总皂甙含量测定结果表明,一年生三七根、芦头、茎、叶4种组织的总皂甙分别为2.73%、11.86%、1.09%、5.96%。对各组结果进行方差分析,P值均为0.0000,表明各组总皂甙含量的差异均有统计学意义,即任意两组的含量均不同:芦头＞叶＞根＞茎。Real-time RT-PCR研究及统计分析表明,一年生三七根、芦头、茎SS基因的表达有差异（P＜0.05）,根的表达量最高,但尚不能确定茎和芦头SS基因的表达量有否差别。研究结果说明SS基因在三七皂甙生物合成途径中具有一定重要作用,SS基因表达量的高低与皂甙含量存在一定的关系。但要充分说明SS基因的表达与皂甙含量之间的关系仍需做进一步的研究。本研究在较为系统地进行了三七三萜合成通路功能酶基因的克隆测序分析,获得其中四个关键酶FPS、SS、SE、CAS的cDNA克隆后,对已知植物三萜或甾醇生物合成途径关键酶的氨基酸序列进行聚类分析,从而探讨三萜生物合成酶基因的进化规律。聚类分析表明,不论是FPS、SS、SE或CAS,五加科的三七、人参与伞形科的积雪草、柴胡均有更密切的聚类关系,揭示五加科人参属与伞形科积雪草属、柴胡属在遗传上亲缘关系较近。这与植物分类学上五加科与伞形科的亲缘关系是一致的。这在分子水平上研究植物物种的进化过程及亲缘关系提供了新的依据。研究结果进一步证明,在同科属的药用植物中,或三萜成分结构类似的植物中,其三萜类皂苷的生物合成途径功能酶基因有高度同源性,与植物进化过程密切相关,同时也可用于指导发掘结构相似的三萜药用植物资源。

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Abstract

第一篇药用植物三萜合成的研究

一、药用植物三萜合成研究的意义

二、药用植物三萜结构类型及有效成分

（一）三萜的主要碳架类型

（二）三萜皂苷类有效成分

三、药用植物三萜的药理作用研究

（一）抗肿瘤活性

（二）保肝活性

（三）免疫调节作用

（四）对心血管系统的调节作用

（五）抗衰老作用

（六）对糖尿病的治疗作用

（七）神经调节及保护作用

（八）抗病毒及抗炎作用

（九）对记忆能力的影响

四、植物三萜生物合成途径研究的热点及其现状

（一）功能酶基因克隆

（二）三萜生物合成有关的关键酶功能分析

（三）三萜生物合成途径功能酶基因表达与三萜合成

（四）转三萜生物合成功能酶基因植物构建及其调控

五、展望

参考文献

第二篇三七根三萜合成功能酶基因克隆与原核表达

一、材料与方法

（一）材料

（二）方法

二、实验结果

（一）三七根三萜生物合成途径酶基因cDNA的克隆

（二）三七根三萜生物合成酶基因原核表达

三、讨论

四、小结

参考文献

第三篇三七鲨烯合酶在根、芦头、茎的表达与三萜皂甙的合成

一、材料与方法

（一）材料

（二）方法

二、实验结果

（一）三七总皂苷含量测定

（二）三七SS基因在根、芦头、茎的表达分析

三、讨论

四、小结

参考文献

第四篇药用植物三萜合成通路分子进化分析

一、材料与方法

（一）已知植物中FPS、SS、SE、CAS、OSC等序列查寻及聚类分析

（二）已知植物中异戊二烯类或萜类物质的分类比较

二、研究结果

（一）植物法呢基焦磷酸合酶（FPS）聚类分析结果

（二）植物鲨烯合酶（SS）聚类分析结果

（三）植物鲨烯环氧酶（SE）聚类分析结果

（四）植物环阿屯醇合酶（CAS）聚类分析结果

（五）不同科属植物含三萜类型

四、讨论

五、小结

参考文献

第五篇总结

一、全文总结

二、创新点

在读博士期间发表文章

附录1 植物三萜生物合成基因克隆有关信息

附表1 HMG CoA Reductase植物来源及相关信息

附表2 植物Farnesyl pyrophosphate synthase相关信息

附表3 植物Squalene synthase（SS）相关信息

附表4 植物Squalene Epoxidase（SE）or Squalene Monooxygenase（SMO）相关信息

附表5 植物Cycloartenol synthase（CAS）相关信息

附表6 植物beta-amyrin synthase（bAS）相关信息

附表7 植物oxidosqulene cyclase（OSC）相关信息

附表8 植物lanosterol synthase（LSS）相关信息

附表9 植物lupeol synthase（LS）相关信息

附表10 植物Other Enzymes Related to Triterpenoid Synthesis相关信息

附录2 本研究已登录GenBank的三七三萜生物合成功能酶基因信息

附录2.1 三七根FPS

附录2.2 三七根SS

附录2.3 三七根SE

附录2.4 三七根CAS

附录2.5 三七根GAPDH

英文缩写符号注释

致谢

博士论文勘误表

药用植物三七三萜合成途径功能酶特征与植物三萜合成通路分子进化

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