论文摘要
【背景及目的】背景：白藜芦醇（Resveratrol，RSV）化学名称为3，4，5-三羟基苯二烯，又名3，4，5-三羟基芪，有顺式和反式两种构型，反式白藜芦醇活性更稳定，生物学活性更加广泛。白藜芦醇是一种植物抗毒素，主要存在于葡萄、藜芦、虎杖等植物中的多酚类化合物，在植物收到病原性攻击和环境恶化时产生，具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗癌、调节血脂等重要作用。近年来白藜芦醇的抗肿瘤作用已成为研究热点，但是对不同的细胞，白藜芦醇诱导细胞凋亡的机制也不尽相同，目前已有文献报道白藜芦醇能够诱导HL-60细胞凋亡，但是机制也并不完全清楚。为此本研究通过体外培养细胞模型，研究白藜芦醇诱导HL-60细胞凋亡机制，为利用白藜芦醇抗肿瘤的临床治疗提供理论基础。目的：1、确定caspase-3通路是否是白藜芦醇诱导HL-60细胞凋亡的途径之一。2、检测白藜芦醇是否能诱导HL-60细胞产生ROS，是否能引起线粒体膜电位的变化及其在白藜芦醇诱导HL-60细胞凋亡中的作用及其机制。3、初步探讨PI3K-AKT，ERK，JNK通路在白藜芦醇诱导HL-60细胞凋亡中的作用。【材料和方法】用不同浓度的白藜芦醇处理处于对数期的人早幼粒白血病HL-60细胞，通过MTT法检测6h，12h，24h不同浓度的白藜芦醇对细胞凋亡的影响；通过caspase-3活性检测试剂盒检测不同时间段，不同浓度的白藜芦醇作用HL-60细胞后的细胞内caspase-3活性的变化情况；通过MTT法检测caspase-3阻断剂与白藜芦醇联合用药后细胞凋亡的影响，进一步确定caspase通路在白藜芦醇诱导HL-60细胞凋亡的作用。通过流式细胞术检测不同时间段，不同浓度白藜芦醇对HL-60作用后过氧化氢，超氧阴离子型ROS的表达水平的变化及线粒体膜电位的变化；并用MTT法检测ROS阻断剂NAC和白藜芦醇联合用药后细胞凋亡变化情况，探究ROS在白藜芦醇诱导HL-60细胞凋亡中的作用；通过超氧化物岐化酶（SOD）活性检测试剂盒及Tris-Gly凝胶法检测白藜芦醇作用HL-60细胞后细胞内SOD活性的变化情况；通过Western Blot技术检测白藜芦醇作用HL-60后，细胞内凋亡相关蛋白p-ERK，p-JNK，p-p38，p-Akt的变化情况；并用MTT法检测ERK阻断剂（U0126），JNK阻断剂，PI3K阻断剂（Wortmannin）与白藜芦醇联合作用对HL-60细胞凋亡的影响情况，进一步探究ERK，JNK和PI3K通路在白藜芦醇诱导HL-60细胞凋亡中的作用；用MTT法检测metformin与白藜芦醇联合用药作用HL-60细胞后，细胞凋亡情况。【结果】1、MTT法检测：白藜芦醇诱导HL-60细胞凋亡呈时间和剂量依赖性；SOD，ERK阻断剂（U0126），JNK inhibitor，metformin不会对白藜芦醇诱导HL-60细胞的凋亡产生明显作用；2、台盼蓝细胞计数法：NAC对白藜芦醇诱导HL-60细胞凋亡没有明显作用。3、流式细胞术检测: 6h，12h，24h不同浓度（0～100μM）的白藜芦醇做用细胞后，随着白藜芦醇浓度升高细胞内的超氧阴离子型ROS升高，过氧化氢水平降低；在同一时间段不同浓度（0～100μM）的白藜芦醇作用HL-60细胞后，随着白藜芦醇浓度的升高线粒体膜电位总体呈降低趋势，在不同时间段线粒体膜电位的降低变化程度不同，6h变化最小，24h最大，12h变化居中。4、Tris-Gly凝胶法检测SOD活性：不同浓度（0～200μM）白藜芦醇作用HL-60细胞24h后，随着浓度的升高总SOD活性、铜锌-SOD无明显变化。锰-SOD活性在200μM白藜芦醇作用HL-60细胞24h后，相对于对照组活性有升高趋势，但变化不大。5、SOD试剂盒检测SOD活性：不同浓度（0～200μM）白藜芦醇作用HL-60细胞24h后，随着浓度的升高总SOD活性，铜锌-SOD，锰-SOD活性均无明显变化。6、Caspase-3活性检测：白藜芦醇可以激活Caspase-3活性。7、Western Blot法检测：24h不同浓度的白藜芦醇作用HL-60细胞后，随着浓度的升高，p-ERK，p-JNK呈下调状态，p-AKT在呈先升高再降低趋势，其中25μM时表达量最高，p-p38表达水平不变。【结论】1．增加caspase-3活性，激发后续的凋亡是白藜芦醇诱导HL-60细胞凋亡途径之一。2.白藜芦醇诱导HL-60细胞凋亡能引起线粒体膜电位的下降，超氧阴离子型ROS上升和过氧化氢下降，线粒体膜电位的下降可能是白藜芦醇诱导HL-60凋亡的途径之一，过氧化氢是白藜芦醇诱导HL-60细胞凋亡的过程的副产物。3.过氧化氢的下降不是由于SOD活性的降低引起。4.白藜芦醇下调p-JNK和p-ERK是否在白藜芦醇诱导HL-60细胞凋亡中起关键作用有待于进一步研究。
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