椪柑花器官和幼果的cDNA文库构建及EST分析

论文摘要

以cDNA文库为基础的ESTs（Expressed Sequence Tags,表达序列标签）技术是一种快速进行基因功能分析及发现新基因的方法。为了开展我国特色椪柑的基因发掘研究,本文构建了椪柑花和幼果的cDNA文库,并以该文库为材料进行5’端EST测序和生物信息学分析。主要结果如下:1、以改良的异硫氰酸胍法从椪柑花和幼果中提取总RNA,分离纯化富含PolyA的mRNA,经反转录酶反转录合成双链cDNA,通过CHROMAS PIN-400柱筛选出其中大于500 bp的片段与载体pDNR-LIB连接,最后用电转化法转化宿主菌ElectroMAXDH5a,构建了椪柑花和幼果的cDNA文库。经质量检测,初级文库的库容为1.13×108个/mL,符合高质量文库的要求。文库的重组率为97%,且插入片段的长度在0.5-2.5 kb之间,说明文库完整、有效,可用于大规模EST序列测定及数据分析。2、从椪柑花和幼果cDNA质粒文库中随机选取503个克隆进行测序,经CAP3软件编辑后,获得长度大于100 bp的有效序列为487条,其序列的平均长度为522bp,序列平均质量数为36.25;另外通过GC含量分析获得EST的GC含量为40.49%。利用CAP3软件对487条有效EST序列进行片段重叠群分析和拼接后共获得298个独立基因（Unigene）,其中包括27个片段重叠群（Contig）和271个独立的ESTs（Singlet）。3、将独立基因（Unigene）以GeneOntology进行功能分类。按照GO的分子功能、生物过程和细胞组分三个不同分类角度分类,把通过BlastX比对获得椪柑有功能描述基因（包括功能确定的及推测功能的）分为11类,即代谢相关基因（Metabolism）占功能描述基因的21.02%、蛋白质合成相关基因（Protein synthesis）占功能描述基因的19.89%、能量代谢相关基因（Energy）占8.52%、细胞内运输相关基因（Transporters）占9.09%、转录相关基因（Transcription）占14.20%、信号转导相关基因（Cellular signal transduction）占4.55%、细胞生长发育相关基因（Cell growth anddivision）占3.98%、细胞抗性及防御相关基因（Disease and defence）占8.52%、细胞结构相关基因（Cell structure and Cellcycle）占3.41%、次生代谢相关基因（Secondarymetabolism）占3.41%、蛋白质降解相关基因（Protein destination and storage）占3.41%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 1 文献综述
• 1.1 前人研究进展
• 1.2 cDNA文库的构建方法和种类
• 1.2.1 cDNA文库的构建方法
• 1.2.2 cDNA文库的种类
• 1.2.3 cDNA文库的应用
• 1.2.3.1 筛选与性状相关的重要基因
• 1.2.3.2 结合芯片技术对生物体基因的时空表达进行研究
• 1.2.3.3 为EST的开发提供材料
• 1.3 表达序列标签（ESTs）及其应用概况
• 1.3.1 EST的概念和特点
• 1.3.2 EST的应用
• 1.3.2.1 构建遗传图谱
• 1.3.2.2 分离与鉴定新基因
• 1.3.2.3 基因差异表达的研究
• 1.3.2.4 比较基因组学研究
• 1.3.2.5 用于制备DNA芯片
• 1.4 生物信息学在EST技术中的应用
• 1.4.1 EST数据库
• 1.4.2 EST序列分析软件
• 1.5 柑橘EST研究
• 1.6 本研究的目的意义和思路
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 样品采集
• 2.1.3 实验试剂与仪器设备
• 2.1.3.1 生化试剂
• 2.1.3.2 主要试剂的配制
• 2.1.3.3 仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 总RNA提取
• 2.2.1.1 实验准备
• 2.2.1.2 总RNA提取与纯化
• 2.2.2 mRNA的分离与纯化
• 2.2.3 第一链cDNA的合成
• 2.2.4 第二链cDNA的合成
• 2.2.5 蛋白酶K消化及sn酶切
• 2.2.6 cDNA大小片断筛选
• 2.2.7 cDNA与载体的连接及纯化
• 2.2.8 重组质粒的电转化反应
• 2.2.9 文库滴度的测定
• 2.2.10 文库扩增和保存
• 2.2.11 文库克隆重组率和插入片段长度的检测
• 2.2.12 EST测序保存及初步分析
• 2.2.12.1 菌体培养
• 2.2.12.2 PCR扩增
• 3 结果与分析
• 3.1 RNA提取
• 3.2 mRNA的分离
• 3.3 双链cDNA合成
• 3.4 cDNA分级
• 3.5 文库质量评价
• 3.6 EST测序分析
• 3.6.1 有效EST序列的获得
• 3.6.2 EST序列拼接分析
• 3.6.3 EST序列同源性比较分析及基因表达功能分类
• 4 讨论与结论
• 4.1 关于材料获取与RNA提取
• 4.1.1 材料的获取与选择
• 4.1.2 RNA提取
• 4.2 cDNA的合成及LD-PCR的应用
• 4.3 关于EST生物信息学初步分析
• 参考文献
• 致谢