草酰腙缩乙醛酸三环己基锡酯诱导大细胞肺癌H460细胞凋亡及其机制研究

论文摘要

研究背景和研究目的据WHO统计,肺癌是当今世界上最大的癌患,其死亡率居于各种恶性肿瘤之首位,中国也已成为世界上第一肺癌大国。按组织学类型可将肺癌分为两大类:小细胞肺癌和非小细胞肺癌。非小细胞肺癌（NSCLC）占肺癌的85%以上。由于非小细胞肺癌转移后禁忌手术,且对放疗很不敏感,因此,对非小细胞肺癌化疗药物的开发与研究尤为重要。肺癌化疗的常用药物有如下五类:直接破坏DNA药物、插入DNA模板药物、影响核酸合成药物、抑制微管装配药物、影响蛋白质合成药物五类。尽管上述药物可有效诱导肺癌细胞凋亡,但是毒副作用较大且容易引起耐药,从而导致化疗失败。因此,开发毒性小、副作用少、能克服多药耐药和有效启动肺癌细胞凋亡信号传导途径的药物是目前亟待解决的问题。本研究选用H460、A549、H1792、H226、WI38细胞为实验细胞研究有机锡小分子化合物抑制NSCLC细胞生长的机制,原因在于:1)此四种NSCLC细胞分别来源于腺癌、大细胞癌、鳞癌,涵盖了非小细胞肺癌的三种亚型;2)此四种NSCLC细胞均可单独作为非小细胞肺癌研究领域里的模式细胞,用于细胞水平的检测;3)迄今对有机锡小分子化合物诱导NSCLC细胞凋亡的机制研究还比较少;4) WI38细胞是从人胚肺组织建立的二倍体成纤维细胞系,作为正常细胞经常被用作肺癌研究的对照细胞。因此可用以上细胞系筛选小分子化合物,并对其机制做深入研究,为NSCLC化疗药物的开发提供理论依据。化学遗传学（chemical genetics）是利用化学工具来研究生物体系的一种新兴手段,其可以在以下两个重要方面促进新药开发:一方面是鉴定出在某种疾病形成过程中起重要作用的基因或蛋白质,从而为新药筛选提供靶点;另外一方面是发现特异性作用于某个基因或蛋白质的小分子化合物,从而为新药开发提供先导化合物。化学遗传学应用的关键之一是要有大量的可供筛选的不同结构的化合物,新兴的组合化学很好地解决了这一难题,在同一个化学反应体系中加入不同结构单元,利用这些结构单元的排列组合,就能够系统地合成大量化合物。近年来,化学遗传学在细胞凋亡研究领域得到了广泛的应用:美国哈佛大学医学院袁钧瑛教授带领课题组进行了“用小分子研究细胞死亡过程中的信号传导:从Bcl-2到程序性坏死”的研究;美国密执安大学癌症中心王少萌教授开展了“合理设计小分子拮抗剂来调控关键性细胞坏死和蛋白质-蛋白质间的相互作用”的研究;另外,美国国立癌症研究所（NCI）早在1997年启动了一项新计划,将化学遗传学应用到癌症治疗研究中,即利用细胞渗透性的小分子化合物触发肿瘤细胞死亡。这充分说明化学遗传学方法为细胞凋亡研究提供了一个可靠的平台,基于此平台,利用具有一定生物活性的小分子化合物作为研究手段来研究细胞凋亡过程中的信号传导,优势明显:小分子化合物易于进入细胞,易于引起细胞表型变化,其作用具有剂量依赖性,适用于多蛋白家族,不会引起细胞的适应性变化等,另外,这些小分子化合物还往往可以作为“先导化合物”,进而指导新药的开发研究。近几年来,本课题组一直在从事有机小分子化合物库的构建工作,目前,库中已包含了60余种有机锡小分子化合物。研究显示,某些有机锡化合物具有抗肿瘤活性,这已经在MCF-7（乳腺癌）、WiDr（结肠癌）、P388（小鼠白血病）等抗癌活性研究中得到证实。这些研究大都停留在生长抑制实验阶段,部分研究显示有机锡化合物可以阻滞肿瘤细胞周期,但对其抑制生长、诱导凋亡的分子机制仍然不清楚。因此,探讨有机锡小分子化合诱导肿瘤细胞凋亡分子机制具有重要意义。基于以上考量,本课题研究目的是:利用化学遗传学这一新兴技术平台,以非小细胞肺癌H460、A549、H1792和H226细胞为研究对象,对草酰腙缩乙醛酸三环己基锡酯（OGTCT）的体外抗肿瘤活性进行研究,进而探讨其诱导H460细胞凋亡的分子机制,为新型肺癌化疗药物的开发提供更加完善的理论依据。研究内容1.鉴定OGTCT对NSCLC细胞、耐药细胞H460/TaxR及人胚肺二倍体成纤维细胞WI38的生长抑制作用。2.探讨OGTCT对H460细胞的凋亡诱导作用。3.分析OGTCT对H460细胞周期分布及周期调控相关蛋白p53、p21、PCNA表达的影响。4.分析OGTCT诱导H460细胞凋亡过程中,凋亡相关调控因子的变化及重要凋亡通路的激活情况。研究方法1细胞生长抑制检测:1.1 MTT法检测细胞存活率,由此对OGTCT进行初步筛选;1.2选择目前临床上常用抗肿瘤药物紫杉醇（Paclitaxel）为对照药物,用MTT法检测其对肿瘤细胞和正常细胞的生长抑制情况,并与OGTCT做比较。2.细胞凋亡检测方法:2.1倒置相差显微镜观察细胞形态变化及凋亡小体;2.2 Hoechst 33258荧光染色,并结合荧光显微镜观察细胞核形态变化;2.3乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒检测细胞是否出现坏死;2.4台盼蓝拒染法进一步检测细胞是否出现坏死;2.5用Nucleosome ELISA试剂盒检测细胞凋亡率。3.细胞周期及其相关调控蛋白表达变化的检测:3.1流式细胞技术检测OGTCT对细胞周期分布的影响;3.2酶联免疫吸附测定技术（ELISA）检测与细胞周期调控相关重要蛋白p53和p21的表达变化;3.3免疫荧光结合激光扫描共聚焦显微镜检测增殖细胞核抗原PCNA的表达及分布;3.4 Western blot检测p53蛋白的表达。4.荧光探针结合激光扫描共聚焦技术检测细胞中钙离子浓度变化。5.检测OGTCT对ICE家族蛋白酶成员激活情况,方法如下:5.1用ApoAlert caspase-3,-8比色检测试剂盒分析caspase-3,-8酶活性变化;5.2用ApoAlert caspase 9/6荧光检测试剂盒分析caspase-9/6酶活性变化;5.3用caspase抑制剂检测caspase-3,8,6,9对OGTCT诱导细胞凋亡的影响。6.免疫荧光结合激光扫描共聚焦显微镜检测抗凋亡蛋白Bcl-2的分布及表达。7.Western blot检测细胞色素C（Cyto-C）的表达变化。8.酶联免疫（ELISA）试剂盒检测Fas/FasL的表达变化。研究结果1.OGTCT抗肿瘤活性检测结果（MTT法检测细胞存活率）1.1 OGTCT对NSCLC细胞、耐药细胞及人胚肺成纤维细胞WI38存活率的影响:在48h内,OGTCT以剂量依赖的方式,显著降低了NSCLC细胞（A549、H1792、H226、H460）和耐药细胞H460/TaxR的存活率;而相同浓度与作用时间下,WI38细胞的存活率远远高于NSCLC细胞和H460/TaxR耐药细胞的存活率。1.2阳性药物对比检测结果:在48h内,紫杉醇以剂量依赖的方式,降低了NSCLC细胞、H460/TaxR细胞及WI38细胞的存活率。但与OGTCT相比,紫杉醇对WI38有显著生长抑制作用,而对耐药细胞H460/TaxR的生长抑制作用极不显著。结果表明:OGTCT与紫杉醇相比有2个明显优势,OGTCT对正常细胞WI38的毒性较小,而对耐药细胞H460/TaxR的生长抑制作用尤为明显。2.OGTCT诱导H460细胞凋亡的研究结果2.1倒置相差显微镜观察细胞形态变化:0.1%DMSO溶剂对照组与对照组相比,细胞形态无明显变化;0.56μM/L的OGTCT处理H460细胞48h后发现,胞体皱缩,胞浆内空泡明显,核固缩,折光性减弱,细胞膜出芽且有脱离现象,凋亡小体形成,细胞呈现出典型的凋亡形态学特征。2.2 H33258染色结合荧光显微镜检测细胞核片段化结果:DMSO溶剂对照组与对照组相比,细胞核形态无明显变化,均呈现均匀亮蓝色;0.56μM/L的OGTCT处理H460细胞48h后发现,细胞核固缩、染色质凝集且有明显边缘化、出现细胞核碎片,凋亡小体清晰可见,呈现典型的凋亡形态学特征。2.3 LDH活性检测结果:OGTCT 0.14、0.28μM/L处理H460细胞48h,与对照组细胞相比,培养液中酶活性变化不显著（p＞0.05,n=3）;而OGTCT 0.56μM/L处理H460细胞48h,与对照组相比,培养液中酶活性显著升高（p＜0.01,n=3）。2.4台盼蓝拒染实验检测表明:OGTCT 0.14和0.28μM/L处理H460细胞48h,细胞坏死率极低;而OGTCT0.56μM/L处理H460细胞48h,细胞坏死率显著增加（p＜0.01,n=3）。2.5 Nucleosome ELISA检测发现:用0.14、0.28、0.56μM/L的OGTCT分别处理H460细胞6h、12h、24h、48h,与对照组细胞相比,OGTCT可有效诱导H460细胞凋亡,并呈明显的剂量时间依赖性。3.OGTCT对H460细胞周期的影响及相关分子机制研究结果3.1 OGTCT对H460细胞周期分布的影响分析细胞DNA变化发现,OGTCT作用24-48 h后可使H460细胞周期阻滞在G0/G1期,不能进入S期,并呈时间依赖性,但对M期的作用不明显。3.2检测p53/p21蛋白表达水平●p53、p21 ELISA检测,发现:OGTCT可使H460细胞的p53和p21蛋白表达升高,随着作用时间的延长,表达水平显著升高,在24h时表达水平最高,此后表达水平逐步降低。●Western Blot检测发现:OGTCT可使H460细胞中p53的表达显著升高（p＜0.01,n=3）。3.3免疫荧光结合激光共聚焦显微技术检测PCNA蛋白表达及分布:0.56μM/L的OGTCT作用于H460细胞48h,与对照组相比,可使PCNA的表达显著降低（p＜0.05,n=3）。4.OGTCT诱导H460细胞凋亡的相关分子机制研究结果4.1免疫荧光探针结合激光共聚焦显微技术检测H460细胞中钙离子变化及分布,发现:OGTCT 0.56μM/L处理48h后,可使H460细胞内的钙离子浓度显著增强（p＜0.001,n=3）。4.2免疫细胞化学法结合激光共聚焦显微技术检测H460细胞中Bcl-2表达发现:用0.56μM/L的OGTCT处理H460细胞48h后,与对照组相比,Bcl-2表达水平显著降低（p＜0.01,n=3）。4.3 Caspases活性检测结果:●ApoAlert caspase-3比色检测试剂盒检测分析发现:0.56μM/L OGTCT处理H460细胞48h后,与对照组相比较,405 nm处光吸收值由0.246上升到0.982（p＜0.001）;●ApoAlert caspase-8比色检测试剂盒检测分析发现:0.56μM/L OGTCT处理H460细胞48h后,与对照组相比较,405 nm处光吸收值由0.132上升到0.787（p＜0.001）;●ApoAlert caspase-9/6荧光检测试剂盒检测分析发现:0.56μM/L OGTCT处理H460细胞48h后,与对照组相比较,caspase-9在460nm处的荧光强度由24.45上升到185.44,其相对活性上调了6.58倍（p＜0.001）;而caspase-6在460nm处的荧光强度由18.36上升到33.55,其相对活性上调了0.82倍（p＜0.01）;结果表明,在H460细胞凋亡过程中,OGTCT同时激活了caspase-3,-8,-9,6。●Caspases抑制剂对OGTCT诱导H460细胞凋亡的影响加caspases抑制剂后,凋亡ELISA试剂盒检测细胞凋亡率,发现:与OGTCT处理的细胞相比,pan-caspase inhibitor（Z-VAD-FMK）完全阻滞了OGTCT诱导的凋亡,caspase-3 inhibitor（Z-DEVD-FMK）、caspase-8 inhibitor（Z-IETD-FMK）和caspase-9 inhibitor（Z-LEHD-FMK）显著逆转了OGTCT诱导的凋亡,而caspase-6 inhibitor（Z-VEID-FMK）显著抑制了OGTCT诱导的凋亡,但程度稍弱。4.4 Western blotting检测Cyto-C的表达Western bloting检测发现:0.56μM/L OGTCT处理H460细胞48h后,可使胞浆中Cyto-C的水平显著增加（p＜0.01,n=3）。4.5 OGTCT处理的H460细胞中Fas/FasL的表达4.5.1 Fas/FasL ELISA assay检测结果ELISA assay检测发现,OGTCT可使H460细胞的Fas蛋白表达升高,随着作用时间的延长,表达水平显著升高,在24h时表达水平最高,此后表达水平有所降低;而mFasL与sFasL的表达水平未发生显著变化（p＞0.05,n=3）。4.5.2 Fas抑制剂ZB4对OGTCT诱导H460细胞凋亡的影响用抗Fas抗体ZB4预先处理H460细胞一定时间后,再用0.56μM/L的OGTCT处理48h,MTT与nucleosome ELISA检测发现,ZB4显著逆转了OGTCT诱导的凋亡与增殖抑制。结论:1.OGTCT以浓度依赖的方式,显著降低NSCLC和H460/TaxR细胞的存活率。OGTCT与紫杉醇相比优势明显:对正常细胞WI38的毒性极小,且能有效克服肿瘤细胞的多药耐药性。2.OGTCT能有效诱导H460细胞凋亡。OGTCT可能通过上调p53和p21蛋白水平、降低PCNA表达的方式将细胞周期阻滞于G0/G1期、下调Bcl-2蛋白表达水平、导致钙离子和Cyto-C释放、激活Fas蛋白、激活caspase-8,-9,-3,-6而发挥其凋亡诱导作用。3.Fas信号通路和线粒体信号通路可能共同参与了OGTCT诱导的H460细胞凋亡过程。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 前言
• 1.肺癌
• 2.细胞周期
• 3.细胞凋亡
• 4.有抗癌活性的有机锡化合物
• 5.化学基因组技术
• 第一部分 草酰腙缩乙醛酸三环己基锡酯抗肿瘤活性研究
• 1.前言
• 2.材料试剂与主要仪器设备
• 3.实验方法
• 4.实验结果
• 5.讨论
• 6 图
• 第二部分 草酰腙缩乙醛酸三环己基锡酯对H460细胞周期影响的研究
• 1.前言
• 2.材料试剂与主要仪器设备
• 3.实验方法
• 4.实验结果
• 5.讨论
• 6.图
• 第三部分 草酰腙缩乙醛酸三环己基锡酯诱导H460细胞凋亡分子机制研究
• 1.前言
• 2.材料与主要仪器设备
• 3.实验方法
• 4.实验结果
• 5.讨论
• 6.图
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表和整理的主要学术论文目录
• 学位论文评阅及答辩情况表
• 附录