虾青素发酵法生产的研究

论文摘要

虾青素以其卓越的抗氧化功能，正越来越受到人们的关注。目前采用发酵法生产虾青素受到产量偏低、对培养条件要求严格、成本偏高等因素的制约。本论文对一株来自海洋泥土中的红酵母所产色素进行了分析，确定其主要成分为虾青素。该红酵母具有对环境要求较粗放，生物量和色素积累迅速的优点。本文通过对该红酵母生长条件的研究，确定了其摇瓶最适装液量，接种量，发酵温度等条件。并建立了一种通过控制温度实现虾青素产量提高的分段降温的发酵方式，使虾青素产量提高20%。通过二次紫外诱变育种的手段获得稳定的正向突变,使色素产量得到提高。并研究如柠檬酸三铵、玉米粉、番茄汁等富含虾青素前体的物质对诱变后红酵母产虾青素的影响。针对该红酵母，通过调整碳氮源，进行单因素和正交试验，最终确定了一种优化的培养基。通过以上手段，得生物量1.31×10~9CFU/ml，色素含量9.41μg/ml。通过研究补料分批发酵对生物量和虾青素产量的影响得出，在酵母生长的指数期补料分批发酵可实现高密度培养。其中连续补料优于间歇补料。研究表明，与分批发酵相比，补料分批发酵的方式的生物量是其2倍以上，可使虾青素产量达到17.03μg/ml。本论文还从海泥当中分离筛选出一株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，利用其可以快速降解虾壳特点，对虾壳进行降解，使虾壳中的虾青素游离。通过使用乙醇等有机溶剂即可将其中虾青素萃取收集。虾青素产率为59.775μg/g干虾壳。与传统的酸洗、碱洗以及油溶的方法相比，使用微生物降解的方法提取虾壳中的虾青素具有明显的优势。在降低成本的同时，提高了提取效率，减少了对环境的污染。研究发现，虾壳在降解过程中形成的降解物经高压灭菌后添加到诱变后的红酵母的优化培养基中，可以提高虾青素产量和红酵母生物量。说明经降解处理后的虾壳是红酵母发酵的优良培养基。该方法在提出虾壳中虾青素的同时为红酵母的发酵提供了培养基，虾壳作为水产加工中的下脚料，在降低了红酵母培养成本的同时提供了额外的虾青素。这使红酵母发酵产虾青素和从虾壳中提取虾青素这两种方法形成了有机的结合。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 虾青素的结构
• 1.1.1 虾青素的几何异构体
• 1.1.2 虾青素的立体异构体
• 1.2 虾青素的功能与应用
• 1.2.1 虾青素的抗氧化功能
• 1.2.2 虾青素的抗癌功能
• 1.2.3 虾青素增强免疫力的功能
• 1.2.4 虾青素预防神经系统以及心血管疾病的功能
• 1.2.5 虾青素提高动物繁殖能力和成活率的功能
• 1.2.6 虾青素的着色功能
• 1.2.7 虾青素消除时差症的功能
• 1.2.8 虾青素的安全性
• 1.2.9 虾青素的应用
• 1.3 虾青素的来源
• 1.3.1 化学合成
• 1.3.2 酵母菌发酵
• 1.3.3 从藻类中提取
• 1.3.4 从甲壳动物中提取
• 1.3.5 细菌合成
• 1.4 发酵法生产虾青素的研究现状
• 1.4.1 酵母菌合成虾青素的途径
• 1.4.2 菌种的选育
• 1.4.2.1 诱变育种
• 1.4.2.2 原生质体融合
• 1.4.2.3 基因工程
• 1.4.3 发酵条件的优化
• 1.4.4 添加前体物质和增强剂
• 1.4.5 高密度培养
• 1.4.6 酵母中虾青素的提取
• 1.4.7 虾青素的检测
• 1.4.7.1 高效液相色谱法（HPLC）
• 1.4.7.2 薄层层析法（TLC）
• 1.4.7.3 分光光度法（Derivative ratio spectrophotometry）
• 1.4.7.4 全波长扫描
• 1.5 研究意义与发展前景
• 1.6 本实验研究内容
• 1.6.1 红酵母中虾青素的定性定量分析
• 1.6.2 红酵母发酵条件的优化
• 1.6.3 红酵母菌种的诱变筛选
• 1.6.4 虾青素前体物质对红酵母的影响
• 1.6.5 红酵母培养基的优化实验
• 1.6.6 红酵母高密度补料发酵
• 1.6.7 利用细菌分解虾壳提取虾青素
• 第二章 红酵母的色素分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 主要设备
• 2.1.3 实验方法
• 2.1.3.1 生物量的检测
• 2.1.3.2 色素的提取
• 2.1.3.3 总类胡萝卜素的定量检测
• 2.1.3.4 总类胡萝卜素的定性检测
• 2.1.3.5 虾青素薄层层析（TLC）与紫外吸收波长扫描联合检测
• 2.1.3.6 高效液相色谱条件
• 2.1.3.7 虾青素含量的确定
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 总色素的分析结果
• 2.2.2 虾青素的分析结果
• 2.2.3 高效液相色谱的定性分析
• 小结
• 第三章 红酵母发酵条件的优化
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 主要设备
• 3.1.3 实验方法
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 装液量的影响
• 3.2.2 接种量的确定
• 3.2.3 酵母最适生长温度的确定
• 3.2.4 生物量和色素积累趋势
• 3.2.5 分段降温发酵对色素产量的影响
• 小结
• 第四章 高产虾青素红酵母的紫外诱变筛选
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 主要设备
• 4.1.3 实验方法
• 4.1.3.1 紫外诱变
• 4.1.3.2 正向突变的筛选
• 4.1.3.3 生物量的检测
• 4.1.3.4 色素的提取
• 4.1.3.5 虾青素的检测
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 照射时间间隔以及菌液稀释比对致死率的影响
• 4.2.2 第一次诱变结果
• 4.2.3 第二次诱变结果
• 4.2.3.1 二次诱变 50S 的结果
• 4.2.3.2 二次诱变 60S 的结果
• 4.2.3.3 二次诱变 90S 的结果
• 4.2.4 正向突变遗传稳定性检验
• 小结
• 第五章 红酵母的培养基优化
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 主要设备
• 5.1.3 实验方法
• 5.1.3.1 生物量的检测
• 5.1.3.2 色素提取的预处理
• 5.1.3.3 色素的提取
• 5.1.3.4 虾青素的检测
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 培养基中虾青素前体物质对发酵的影响
• 5.2.1.1 柠檬酸三铵对发酵的影响
• 5.2.1.2 玉米粉对发酵的影响
• 5.2.1.3 番茄汁对发酵的影响
• 5.2.1.4 β-类胡罗卜素对发酵的影响
• 5.2.2 碳源的优化
• 5.2.3 氮源的优化
• 5.2.4 K2HPO4的添加对发酵的影响
• 5.2.5 正交实验
• 小结
• 第六章 红酵母的高密度补料发酵
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 主要实验材料
• 6.1.2 主要仪器设备
• 6.1.3 实验方法
• 6.1.3.1 生物量的检测
• 6.1.3.2 色素的提取
• 6.1.3.3 虾青素的定量检测
• 6.1.3.4 糖浓度的测定
• 6.1.3.5 糖浓度标准曲线
• 6.1.3.6 生长速率与残糖曲线的测定
• 6.1.3.7 指数间歇补料的方法
• 6.1.3.8 指数连续补料的方法
• 6.2 结果与讨论
• 6.2.1 生长曲线和残糖曲线
• 6.2.2 指数间歇补料对发酵的影响
• 6.2.3 指数连续补料对发酵的影响
• 小结
• 第七章 细菌降解虾壳提取虾青素及其与红酵母的结合应用
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 实验材料
• 7.1.2 主要仪器
• 7.1.3 实验方法
• 7.2 结果与讨论
• 7.2.1 降解虾壳细菌的筛选
• 7.2.1.1 平板筛选结果
• 7.2.1.2 降解能力比较
• 7.2.2 降解条件的优化
• 7.2.3 萃取溶剂的选择
• 7.2.4 几种提取虾壳中类胡萝卜素方法的横向比较
• 7.2.5 提取物中类胡萝卜素的分析
• 7.2.6 菌种的初步鉴定
• 7.2.7 虾壳降解物对红酵母发酵的影响
• 小结
• 第八章 结论
• 8.1 海洋红酵母发酵产虾青素的相关结论
• 8.2 微生物降解虾壳产虾青素及以其降解产物培养红酵母的相关结论
• 参考文献
• 致谢