毒死蜱胁迫下斑马鱼胚胎蛋白质组的差异表达

论文摘要

毒死蜱是目前世界上生产和销售量最大的有机磷杀虫剂之一,随着我国经济发展对粮食需求量的增加,粮食和经济作物的多种病害并存以及农药残留量的增加使病虫害的抗药性迅速增加,迫使农民越来越多地使用农药,同时,随着一些高毒的有机磷农药被禁止生产和使用,毒死蜱等中低毒有机磷农药被大量的使用。由毒死蜱引发的人和动物所产生的多种毒性反应已引起人们的广泛关注。本论文选用斑马鱼这一新型的毒理模式动物,研究了毒死蜱对斑马鱼胚胎的急性毒理,在表型上观察了毒死蜱对斑马鱼胚胎发育的影响,结果显示:毒死蜱能引起很多的毒理学终点:如动物极破裂,细胞分裂不规律,外包不完全,脊柱弯曲,黑色素不全,卵黄囊病,卵凝结,尾部不分离,心率降低,孵化率降低等。同时统计了孵化率、心率、畸形等与毒死蜱浓度的相关性。为毒死蜱的合理使用提供了科学依据。借助双向电泳、质谱分析等蛋白质组学分析方法,构建斑马鱼胚胎的蛋白质表达谱。利用Imagemaster 2D Elite 6.01分析软件,分析得到在250ppm浓度的毒死蜱胁迫下,24hpf斑马鱼胚胎产生的19个差异蛋白质,这些差异蛋白都是体积百分比变化均大于2倍甚至3倍,且符合t检验（p<0.05）的显著差异蛋白点。通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术（MALDI-TOF-MS）获得了这些差异蛋白质的肽质量指纹图谱（PMF）,并通过对斑马鱼蛋白数据库检索,初步鉴定得到4个差异蛋白,其中,下调表达蛋白三种,分别是:神经调节蛋白2b （neuregulin 2b）、肌节同源盒C（muscle segment homeobox C）、B细胞受体结合蛋白（B-cell receptor-associated protein 31）;上调表达蛋白一种:酪蛋白激酶1α1-like （CSNK1A1L - casein kinase 1, alpha 1-like）。通过这些初步的质谱鉴定结果,首先我们验证了毒死蜱的传统毒理机制,即:毒死蜱对神经具有明显的毒理作用。揭示了毒死蜱能影响细胞的发育及凋亡、胞内蛋白运输、转录调控、信号转导等,使我们对毒死蜱的毒理学有了进一步的了解。在毒死蜱胁迫下,斑马鱼还能开启部分磷酸化依赖的信号通路,通过体内自我的调节以应对外来有毒物质的入侵。综上所述,本论文对毒死蜱的毒理学在表型和分子水平上进行了综合研究,深入分析了毒死蜱的毒理学机制,揭示了毒死蜱的几种新的毒理可能靶标分子。本研究结果为进一步揭示毒死蜱的毒理代谢网络,探究毒死蜱毒理作用的机制,为减少毒死蜱对动物的毒理作用及其合理使用提供科学依据和技术支持。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 毒死蜱的研究进展
• 1.1.1 毒死蜱的理化性质及毒理特征
• 1.1.2 毒死蜱毒理机制研究进展
• 1.2 斑马鱼作为毒理模式动物的研究进展
• 1.2.1 斑马鱼的基本生物学特性
• 1.2.2 斑马鱼作为毒理模式动物的优点
• 1.2.3 斑马鱼胚胎发育
• 1.3 斑马鱼及胚胎在毒理学中的研究方法及进展
• 1.3.1 急性毒理表型分析
• 1.3.2 转录组水平
• 1.3.3 蛋白质组水平
• 1.4 本论文研究的科学意义
• 1.5 研究内容
• 1.6 技术路线
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 斑马鱼
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 仪器
• 2.1.4 溶液配置
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 斑马鱼的养殖
• 2.2.2 配鱼及收卵
• 2.2.3 96 小时的急性毒理试验
• 2.2.4 24hpf 胚胎全蛋白样品制备
• 2.2.5 2D 分离蛋白及染色
• 2.2.6 图像采集及软件分析
• 2.2.7 质谱
• 第三章 结果与分析
• 3.1 毒死蜱对斑马鱼胚胎的急性毒理表型分析
• 3.1.1 表型分析
• 3.1.2 统计学分析
• 3.2 构建斑马鱼胚胎的蛋白质表达谱
• 3.2.1 卵黄蛋白的去除
• 3.2.2 双向电泳结果
• 3.3 利用 Imagemaster 2D Elite 6.01 软件分析差异蛋白点
• 3.4 对差异蛋白点做质谱分析
• 3.5 对差异蛋白点功能的讨论
• 第四章 讨论
• 4.1 胶条 pH 范围的选择
• 4.2 染色方法的讨论
• 4.3 下一步的工作设想
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历