经鼻给予多巴胺对MPTP小鼠和正常大鼠的影响

论文摘要

21世纪随着人类寿命延长和人口特征的变化,中枢神经系统疾病的发病率将显著增加,其中与年龄相关的神经退行性疾病如:帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病等在发病机制和病理方面已被系统阐述,然而,此类疾病的治疗策略仍十分有限,其中关于药物如何有效地转运至神经系统成为最具有挑战性的难点,增强药物转运地治疗策略引起广泛重视。相信随着我们对神经系统退行性疾病生物学认识的加深,将产生更多的治疗机遇,关于药物投递治疗的研究将在中枢神经系统治疗由实验室向临床实践转化中发挥重大作用。帕金森病（parkinson’s disease,PD）是一种常见的中枢神经系统变性性疾病,其病理特征是中脑黑质（substantia nigra,SN）致密部的多巴胺能神经元变性脱失。僵直、震颤、运动迟缓、严重时运动不能等帕金森样症状是导致运动障碍的主要原因。目前尚无治愈帕金森的方法,我们掌握的治疗手段包括多巴胺前体左旋多巴、多巴胺脱羧酶抑制剂、儿茶酚-氧位-甲基转移酶抑制剂、多巴胺受体激动剂、抗胆碱能药物及单胺氧化酶抑制剂等来改善症状。此外,各种生长因子凸显出神经保护作用。左旋多巴替代治疗为临床症状的治疗方法,但长期使用会出现―开-关‖现象、运动及精神障碍等副作用,药物浓度不稳定为其主要原因,因此寻求一种稳定药效浓度的治疗方式具有重要的意义。传统和新的疗法都需要更适合的药物转运途径,将其导入中枢神经系统后发挥作用,而中枢神经系统存在着很多因素影响或阻碍着药物特别是大分子药物的投递。有文献报道经鼻给予多巴胺对药效浓度的稳定及帕金森病具有一定积极的影响,但其作用机制尚未完全明了。本研究旨在观察经鼻给予多巴胺对mptp损伤和正常多巴胺能神经元的影响,探讨其可能的作用机制。实验一经鼻给予多巴胺致MPTP小鼠的行为学变化爬杆实验和悬挂实验可反映小鼠肢体的协调能力,平均爬杆总时间越长,肢体协调能力越差,平均悬挂分数越低,肢体协调能力越差。爬杆实验中,观察4组小鼠（n=8）两个时间点（第5天和第10天）的数据。实验第5天的数据显示:正常小鼠组平均爬杆总时间为12.00±0.15,模型给药组平均爬杆总时间为20.34±1.76,模型组平均爬杆总时间为44.24±12.08,正常给药组平均爬杆总时间为12.34±0.27。据统计学数据软件,模型给药组与模型组之间爬杆总时间有显著性差异（p<0.05）,模型给药组小鼠较模型组小鼠爬杆时间明显缩短,显示模型给药组小鼠的肢体协调能力较模型组良好。实验第10天的数据显示:正常小鼠组平均爬杆总时间为12.15+1.86,模型给药组平均爬杆总时间为26.79±4.24,模型组平均爬杆总时间为36.54±6.68,正常给药组平均爬杆总时间为10.68±0.65。据统计学数据软件,模型给药组较模型组爬杆时间明显缩短,显示模型给药组小鼠的肢体协调能力较模型组良好。以上数据表明,经鼻予以多巴胺对MPTP小鼠的肢体协调能力有促进作用,间接显示经鼻予以多巴胺对MPTP小鼠多巴胺能神经元有保护和促进作用。悬挂实验中,观察4组小鼠（n=8）两个时间点（第5天和第10天）的数据。实验第5天的数据显示:正常小鼠组平均悬挂得分为:3.00±0.00,模型给药组小鼠平均悬挂得分为:2.68±0.64,模型小鼠组平均悬挂得分为:1.47±0.68,正常给药小鼠组平均悬挂得分为:3.00±0.00。据统计学数据软件,模型给药组平均悬挂得分明显高于模型小鼠组,显示模型给药组小鼠的肢体协调能力较模型组良好。实验第10天的数据显示:正常小鼠组平均悬挂得分为:3.00±0.00,模型给药组小鼠平均悬挂得分为:2.35±1.00,模型小鼠组平均悬挂得分为:1.54±0.45,正常给药小鼠组平均悬挂得分为:3.00±0.00。以上数据亦表明,经鼻给予多巴胺对MPTP小鼠的肢体协调能力有促进作用,亦即多巴胺对MPTP小鼠多巴胺能神经元有保护和促进作用。实验二经鼻给予多巴胺致MPTP小鼠免疫组织化学变化应用免疫荧光组织化学方法对多巴胺能神经元进行检测,TH免疫化学染色是反应多巴胺能神经元数量及形态的经典方法。免疫荧光方法的应用亦可以通过荧光度强弱的检测辅助显示不同组间多巴胺能神经元的差异性。按照实验一划分方法,将给药10天后的4组小鼠（n=8）（包括正常生理盐水组,MPTP模型组,MPTP模型给药组,正常给药组）多聚甲醛灌注、取材后进行免疫组织化学染色,处理标本后于荧光显微镜下观察4组小鼠嗅球、纹状体、黑质多巴胺能神经元的数量、形态或及荧光度强弱的差异性。以黑质部位为例,与对照组（80.33±45.15）相比,模型组的TH阳性神经元数量明显减少（40.15±10.35,p<0.05）,模型给药组的TH阳性神经元数量（60.25±3.55,p<0.05）与模型组相比明显增多。通过以上数据,经鼻予以多巴胺递药途径可行性强,从半定量水平上证实此途径予多巴胺能神经元有一定的保护和促进作用,其机制可能与外源性给药有关,但是否有内源性促进作用还有待于进一步证实。对照组（80.33±45.15）与正常给药组（83.22±32.10）相比,虽然从数据上显示正常给药组有微弱的优势,但并无显著性差异。同样,于嗅球、纹状体部位的免疫组织化学结果中,模型给药组较模型组亦有一定的差异性,显示经鼻多巴胺投递途径的可行性及其多巴胺能神经元的保护和促进作用。实验三长时程经鼻给予不同剂量多巴胺后的大鼠脑组织免疫组化分析予以实验大鼠不同剂量多巴胺（1.5mg/kg组,3mg/kg组,6mg/kg组）慢性长程（14day）经鼻投放,在末次给药后,灌注大鼠,荧光免疫组织化学法观察嗅球、纹状体、黑质TH阳性表达的神经元和纤维数目、形态等,并与设立的空白对照组进行比较,探讨多巴胺经鼻投放的外源性及内源性系统变化及剂量-效果关系。SD大鼠（n=6）依经鼻多巴胺投放剂量分为1.5mg/kg、3mg/kg、6mg/kg、空白组慢性长程（14d）给药四组（各组n=6）,慢性长程给药方法同前,在最后一次给药的6h处死动物,免疫荧光化学染色观察TH阳性表达。通过实验结果,显示1.5mg/kg、3mg/kg、6mg/kg、空白组这四组的多巴胺能神经元数量、形态及免疫荧光度无显著性差异,此实验结果提示:似乎对于正常生理组织中,经鼻药物投递途径对多巴胺能神经元的促进作用不显著;或对于经鼻予以多巴胺机制阐述中,关于是否通过内源性途径促进多巴胺能神经元的观点未能从酪氨酸羟化酶免疫组织化学染色途径得到证实。结论1建立理想的模型对于探索发病机制、寻求药物治疗是极为重要的。MPTP小鼠模型是目前应用最广泛的PD模型,以往的研究证实MPTP小鼠模型在组织化学和生物化学上均符合临床PD的特征,是一种较理想的PD模型。[71]本实验选取昆明鼠连续10d给予MPTP后,在爬杆、悬挂行为学实验中均表现出运动障碍。TH是多巴胺合成的限速酶,可作为多巴胺能神经元的标志,本实验中模型组的TH阳性神经元明显减少,从行为学和组织化学两方面证明模型制备成功。2本实验经鼻给予小鼠多巴胺后（0.12mg/kg）预处理发现此途径给药能明显缓解MPTP诱导的PD模型的行为障碍,同时免疫组化也显示经鼻给予多巴胺减轻了PD小鼠嗅球、纹状体、黑质多巴胺能神经元的脱失,证实经鼻给予多巴胺对神经有积极的影响。3不同剂量多巴胺之于大鼠经鼻投放后,TH染色致大鼠黑质、纹状体、嗅球的多巴胺能神经元数量及免疫荧光组织化学染色显示不同组别之间并无明显差异性表现。有关文献报道:经鼻予以多巴胺可致多巴胺受体及多巴胺转运体较对照组增加,且与经鼻多巴胺投放剂量成正相关。[72][73][74]提示:可能与多巴胺在正常神经元内的代谢途径有关,猜测在多巴胺能神经元的正常代谢途径中,经鼻给予多巴胺途径并不明显影响正常神经元内酪氨酸羟化酶的代谢变化,致此试验中各组标本结果无显著性差异。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 1 PD 的药物治疗
• 2 目前治疗上主要存在以下问题
• 3 治疗帕金森的总方向
• 4 治疗中枢系统疾病的新途径
• 5 展望
• 实验一 经鼻给予多巴胺致MPTP 小鼠的行为学变化
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验二 经鼻给予多巴胺致MPTP 小鼠的免疫组织化学变化
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验三 经鼻长时程给予不同剂量多巴胺后的大鼠脑组织免疫组化分析
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 1 经鼻药物释放是否能够增加药物在重要组织或细胞有效性
• 2 多巴胺经鼻投放对中枢神经系统损伤多巴胺能神经元的保护和作用
• 3 多巴胺经鼻投放对中枢神经系统内源性多巴胺能神经元可能的作用
• 参考文献
• 附录
• 个人简历和研究成果
• 致谢