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橘林油脂酵母△9-和△15-脂肪酸去饱和酶基因的克隆及功能验证

2020-12-11阅读(373)

橘林油脂酵母△9-和△15-脂肪酸去饱和酶基因的克隆及功能验证

论文摘要

脂肪酸是人类重要的营养来源,其中的多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated Fatty Acids, PUFAs）是人体重要的生理活性物质。多不饱和脂肪酸中的亚油酸（Linoleic acid, LA）和α-亚麻酸（α-linoleic acid, ALA）是人体的必需脂肪酸,为人体合成下游长链PUFAs所必需。利用微生物发酵法生产PUFAs,不仅具有成本低廉、生产周期短以及受环境影响小等优点,而且更是生产长链的稀缺PUFAs的重要资源。本研究以橘林油脂酵母（Lipomyces kononenkoae）为实验材料,克隆与亚油酸和α-亚麻酸合成相关的Δ9-和△15-脂肪酸去饱和酶基因（lkfad9和lkfad15）,并验证功能。主要得到以下结果：1.通过对培养基成分和培养条件的优化试验,找出橘林油脂酵母发酵生产PUFAs的主要影响因素,确定其高产PUFAs的最优化培养基及培养条件。2.利用脂肪酸去饱和酶（Fatty Acid Desaturase, FAD）的保守区域设计简并引物,克隆橘林油脂酵母Δ9-和△15-FAD的核心编码序列,并采用基因组步移及逆转录PCR等技术,克隆了两个基因完整结构基因序列。生物信息学分析,两个基因均属于脂肪酸脱氢酶超家族,与其他酵母中相应的FAD具有较高同源性。3.将基因lkfadl5分别转入毕赤酵母（Pichia pastoris） GS115和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） INVScI,发酵重组酵母,诱导外源基因表达后收集菌体,气相色谱分析重组菌株的脂肪酸成分。结果显示,基因lkfadl5能通过催化LA变为ALA而提高毕赤酵母GS115中ALA的含量（从4.68%增加到21.93%）,并且能仅利用油酸作为底物,在酿酒酵母INVScI中产出LA和ALA,这个结果显示lkfad15同时具有△12-和△15-FAD的活性。本研究证实了橘林油脂酵母△15-脂肪酸去饱和酶基因lkfadl5同时具有△12-和△15-FAD脱氢作用的双功能,为利用双功能的脂肪酸去饱和酶LKFAD15在转基因生物中富集ω-3系列多不饱和脂肪酸提供了重要的应用基础。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 英文缩略表
  • 第一部分 文献综述
  • 1.1 多不饱和脂肪酸概述
  • 1.1.1 多不饱和脂肪酸的概念
  • 1.1.2 多不饱和脂肪酸的生物合成
  • 1.1.3 多不饱和脂肪酸的生理功能
  • 1.2 脂肪酸去饱和酶的研究概况
  • 1.2.1 脂肪酸去饱和酶简介
  • 1.2.2 脂肪酸去饱和酶的分类
  • 1.2.3 脂肪酸去饱和酶的结构
  • 1.2.4 脂肪酸去饱和酶的研究进展
  • 1.3 真菌产油脂的研究现状
  • 1.3.1 产油微生物的特点
  • 1.3.2 产油酵母的种类
  • 1.3.3 培养条件对产油的影响
  • 1.4 脂肪酸去饱和酶的异源表达
  • 1.4.1 表达系统的种类
  • 1.4.2 大肠杆菌表达系统
  • 1.4.3 酿酒酵母表达系统
  • 1.4.4 毕赤酵母表达系统
  • 1.5 本课题研究的内容和意义
  • 1.5.1 本课题的立题依据
  • 1.5.2 本课题的研究思路
  • 1.5.3 本课题的研究内容
  • 1.5.4 本课题研究的目的及意义
  • 第二部分 高产多不饱和脂肪酸的酵母培养基的优化
  • 2.1 引言
  • 2.2 材料和设备
  • 2.2.1 实验材料
  • 2.2.2 仪器设备
  • 2.3 正交试验（Orthogonal Experiment）
  • 2.3.1 菌种活化
  • 2.3.2 正交试验设计
  • 2.4 菌体的收集和处理
  • 2.5 气相色谱分析（Gas Chromatography,GC）
  • 2.5.1 样品的预处理
  • 2.5.2 气相色谱仪的类型及程序
  • 2.5.3 内标法分析样品脂肪酸的组成及含量
  • 2.6 正交试验和极差分析的结果
  • 2.6.1 正交试验结果
  • 2.6.2 极差分析结果
  • 2.7 分析和结论
  • 2.7.1 结果分析
  • 2.7.2 小结
  • 第三部分 橘林油脂酵母Δ9-和△15-脂肪酸去饱和酶基因的克隆
  • 3.1 引言
  • 3.2 材料和设备
  • 3.2.1 菌株
  • 3.2.2 酶和试剂
  • 3.2.3 培养基和溶液
  • 3.2.4 仪器和设备
  • 3.3 实验方法
  • 3.3.1 大型真菌总DNA的抽提（Cenis,1992）
  • 3.3.2 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
  • 3.3.3 基因组步移（Genome Walking）
  • 3.3.4 引物序列
  • 3.3.5 Δ9-和△15-FAD核心片段的克隆
  • 3.3.6 目的片段的回收
  • 3.3.7 目的片段的获取
  • 3.3.8 基因组步移法（Genome Walking）克隆结构基因的全长序列
  • 3.3.9 逆转录PCR（RT-RCR）克隆目的基因对应的cDNA全长
  • 3.4 结果与分析
  • 3.4.1 橘林油脂酵母总DNA的提取
  • 3.4.2 降落PCR（Touch-down PCR）获得基因的核心序列
  • 3.4.3 接头PCR（Adaptor-PCR）获得基因片段的侧翼序列
  • 3.4.4 热不对称交错PCR（TAIL-PCR）获得基因片段的侧翼序列
  • 3.4.5 逆转录PCR（RT-PCR）获得cDNA的全长序列
  • 3.4.6 系统进化树
  • 3.4.7 蛋白序列的特征
  • 3.4.8 蛋白的跨膜结构及疏水性
  • 3.5 小结
  • 第四部分 橘林油脂酵母△15-脂肪酸去饱和酶基因lkfad15的异源表达
  • 4.1 引言
  • 4.2 实验材料
  • 4.2.1 菌株和质粒
  • 4.2.2 酶和试剂
  • 4.2.3 培养基和溶液
  • 4.2.4 仪器和设备
  • 4.3 △15-脂肪酸去饱和酶基因lkfad15转化酿酒酵母INVScI
  • 4.3.1 重组表达载体pHBM354-lkfad15的构建
  • 4.3.2 原始载体pHBM354与重组载体pHBM354-lkfad15转化酿酒酵母INVScI
  • 4.3.3 原始载体pHBM354与重组载体pHBM354-lkfad15的诱导表达
  • 4.4 △15-脂肪酸去饱和酶基因lkfadl5转化毕赤酵母GS115
  • 4.4.1 重组表达载体pHBM906-lkfad15的构建
  • 4.4.2 原始载体pHBM906与重组载体pHBM906-lkfad15转化毕赤酵母GS115
  • 4.4.3 原始载体pHBM906与重组载体pHBM906-lkfad15的高密度诱导表达
  • 4.5 结果与分析
  • 4.5.1 重组表达载体pHBM354-lkfad15和pHBM906-lkfad15的鉴定
  • 4.5.2 诱导产物的气相色谱分析
  • 4.6 小结
  • 本研究的创新点
  • 参考文献
  • 致谢
  • 作者简历

    • 相关论文文献

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