论文摘要
羊泰勒虫是一类寄生于羊血液细胞的泰勒科泰勒属的血液原虫,由其引起的疾病总称羊泰勒虫病（Ovine and caprine theileriosis）。羊泰勒虫病危害严重,可引起羔羊和外地引进羊大量死亡,使慢性发病的山羊和绵羊生长发育变缓,产肉量和产毛量显著下降,从而给养羊业造成巨大经济损失。传统的诊断方法主要有血液涂片染色镜检、间接荧光抗体试验、间接酶联免疫吸附试验等,但这些方法均有不同程度的缺点。因此有必要建立一种快速、敏感、特异诊断方法,以便进行羊泰勒虫病的早期诊断和预防。本研究根据GenBank中报道的羊泰勒虫18S rRNA和表面蛋白基因序列,利用Olig06.0和Primer Premier 5.0软件分别设计了两对特异性引物,扩增出长为671bp和610bp两条特异性基因片断,并分别克隆到pGEM-T Easy载体上,经酶切分析、PCR鉴定后,筛选阳性克隆的重组质粒进行核苷酸序列分析及同源性比较。结果表明,测得的羊泰勒虫吉林分离株18S rRNA基因序列与羊泰勒虫基因序列China 1（AY492086）、China 2（AY262121）同源性分别为100%和96.0%,与国外报道的绵羊泰勒虫（AY260172）同源性为97.0%,与山羊泰勒虫（AF081135）同源性为96.4%;测得的羊泰勒虫吉林分离株表面蛋白基因与羊泰勒虫表面蛋白China 1的同源性为99.5%。在以上研究内容的基础上.建立了检测羊泰勒虫18S rRNA基因和表面蛋白基因的两种常规PCR诊断方法和一种检测羊泰勒虫18S rRNA基因半套式PCR诊断方法。并通过平行检测51份羊血液样本,对3种PCR方法进行了比较,结果表明半套式PCR方法阳性检出率优于两种常规PCR方法。本研究建立的半套式PCR方法可检测到0.016fg的质粒DNA含量,比常规PCR方法敏感100倍。所建立的半套式PCR具有敏感性高、特异性强、稳定性好等特点,完全实用于羊泰勒虫病的早期诊断及疫情检测。应用所建立的半套式PCR方法对吉林省珲春地区的130头份血液样本进行检测,并与血液涂片染色镜检进行了比较。结果表明,半套式PCR方法的阳性检出率为35.38%,而血液涂片染色镜检阳性率仅为15.38%。