论文摘要
中国西南马是我国马种主要生态类型之一,经历了遗传变异和自然选择的长期进化过程,在西南地区逐渐分化形成了百色马、贵州马、文山马、乌蒙马、大理马、建昌马、腾冲马、中甸马等优良类群。受其特殊历史、自然、社会诸多条件的影响,西南马形成体形矮小、结构紧凑、抗逆性强、善走山路等特点,可以广泛用于科学研究、观光旅游、艺术表演、骑乘培训、驮负运输等,是中国乃至世界原始矮马资源的宝贵基因库。可见,中国西南马在遗传资源保护利用和现代马业发展中具有重要地位。但国内外关于西南马遗传多样性、起源进化、亲缘关系、资源分布、矮小机理等方面的研究还相对缺乏。本课题在对西南地区马进行初步调查的基础上,运用SAS、SPSS统计分析软件对西南马资源特征进行分析;通过PCR-SSCP技术、PCR产物纯化直接测序等方法,对七个类群的西南马及引入品种Shetland马共150个样品的mtDNA D-Loop区、ND3、ND4、ND4L基因和核内SHOX基因的多态性进行了检测,并进行了多态性与体尺指标相关分析,了解了西南马群体资源表型、分子特征。本文得出以下基本结论:（1）中国西南马在数量上已经成为我国五大类型马的第一大类群,影响其数量分布的主要因子是人均农机、人口密度、辖区比重等。非密度制约因子如年无霜期、降水量、日照时数和平均气温等自然因素均与中国西南马体高呈强相关,对不同类群马的形成可能起重要作用。（2）对中国西南马mtDNA D-Loop位点进行了研究,结果表明:中国西南马种内遗传多样性相对丰富,在类型间和类型内遗传分化不显著（P>0.05）;中国西南马具有多个母系起源,且与蒙古国蒙古马亲缘关系较近,部分西南马起源于普氏野马或蒙古野马。（3）在ND4L、ND4基因上游和下游检测到多态:ND4L和ND4上游片段出现两种单倍型（定义为A和B）,而且B单倍型出现频率均略高于A单倍型;ND4下游片段中,出现四种单倍型,其中一个为共享单倍型,三个为稀有单倍型。（4）西南马线粒体ND4基因和ND4L基因核苷酸组成的偏倚不严重,但在密码子第二和第三位点上,C的含量远远大于G含量,而且密码子的使用存在偏倚。（5）所研究的西南马（不包括建昌马）各类群内核苷酸多样性（Pi）较高,在0.00467至0.00737之间,其中大理马最低,乌蒙马最高。各类群间的遗传距离很小,而乌蒙马与其它西南马的遗传距离最大（0.006）;类群间的核苷酸分化系数（Nst）在-0.35665至0.01694之间,乌蒙马与其它马种的核苷酸分化系数均较大,且同处云南地区的乌蒙马与大理马之间的Nst值最大,可见乌蒙马与大理马存在遗传分化。（6）本文对ND4下游片段的多态性与体尺性状进行了关联分析,结果表明基因型对体长影响显著（P<0.05）:D基因型的体长较其余基因型大;对体高和管围的影响接近显著水平（P =0.0809和0.0753）,对胸围影响不显著。（7）西南马种内遗传多样性低,类群间的遗传距离小,遗传相似度高。乌蒙马独立性最高（Pi=0.00737）,可作为独立的管理单元;大理马核苷酸多样度最低（Pi=0.00467）,分化最小（k=3.167）,保持着类群特有的遗传特质,应该得到良好的保护。（8）本研究还首次克隆了西南马矮小性状基因SHOX的部分序列。其长度为520bp,与其他物种已知的SHOX基因序列比对,发现克隆所得的序列是马SHOX基因编码区的部分序列,包含了完整的第二外显子。（9）通过对马SHOX基因第二外显子序列与其它物种相应区域序列进行比较发现:不同物种间的第二外显子较保守,未出现不同片段的插入、缺失及短串联重复序列多态现象,且马的SHOX基因富含GC（7个类群马平均为67.85%）。（10）通过PCR-SSCP分析,检测到在SHOX基因P2位点268处有一个G→A的突变, 431处有一个T→G的突变,导致了等位基因B变为等位基因A。（11）不同类群马SHOX基因P2位点纯合度（Ho）、杂合度（He）、有效等位基因数（Ne）及多态信息含量（PIC）分析表明:多态信息含量（PIC）以文山马最高,为0.513,处于高度多态;以设特兰马为最低,仅为0.222。
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摘要Abstract1 引言1.1 马属动物分类1.2 马的起源进化1.2.1 野马起源1.2.2 家马起源1.2.3 西南马起源1.3 马的遗传资源1.3.1 动物遗传资源多样性1.3.1.1 动物遗传资源概念1.3.1.2 动物遗传资源多样性1.3.1.3 动物遗传资源多样性研究的目的1.3.2 多样性与保护生物学1.3.3 动物遗传资源多样性分子标记技术1.3.3.1 聚合酶链式反应－限制性片段长度多态性技术（PCR－RFLP）1.3.3.2 聚合酶链式反应-单链构象多态技术（PCR-SSCP）1.3.3.3 PCR-DNA 序列分析1.3.3.4 微卫星标记技术（SSR）和DNA 指纹技术（DFP）1.3.3.5 随机扩增多态性DNA 技术（RAPD）1.3.3.6 扩增片段长度多态性技术（AFLP）1.3.3.7 DNA 芯片技术1.3.4 中国马种遗传资源1.3.4.1 马种分类1.3.4.2 西南马概述1.4 马遗传学研究进展1.4.1 遗传学基础理论1.4.1.1 获得性状遗传学说1.4.1.2 自然选择学说1.4.1.3 现代综合进化论1.4.1.4 分子进化中性论1.4.2 马遗传学研究1.4.2.1 马的表型遗传学1.4.2.2 马的细胞遗传学1.4.2.3 生化遗传学研究1.4.2.4 马分子遗传研究1.4.3 候选基因研究进展1.4.3.1 马 mtDNA D-Loop 区1.4.3.2 NADH 脱氢酶亚基基因1.4.3.3 矮小性状基因（SHOX）1.5 本研究目的与意义2 西南马遗传资源特征分析研究2.1 调查方案2.2 技术规范2.2.1 技术要求2.2.1.1 调查步骤2.2.1.2 调查数量2.2.2 用具用品2.2.3 数据处理2.3 调查结果2.3.1 数量分布2.3.2 体尺指标2.4 结果分析2.4.1 存栏数量分析2.4.1.1 影响数量分布的因子分析2.4.1.2 因子选择2.4.1.3 分析结果2.4.1.4 建立模型2.4.2 体尺指标分析2.4.2.1 群体结构2.4.2.2 个体结构2.4.2.3 影响马体尺指标因子分析2.4.2.3.1 指标选择2.4.2.3.2 因子分析2.4.2.3.3 建立模型2.5 讨论2.5.1 分布特征2.5.1.1 民族特征2.5.1.2 资源特征2.5.1.3 经济特征2.5.1.4 种间特征2.5.2 体尺结构特征2.5.2.1 群体特征2.5.2.2 个体特征2.5.2.3 自然特征2.6 小结3 西南马 mtDNA D-Loop 区分子遗传特征研究3.1 材料与方法3.1.1 实验动物和样品采集3.1.2 实验试剂3.1.2.1 生化试剂与分子生物学试剂3.1.2.2 普通试剂3.1.3 菌株和克隆载体3.1.4 溶液与缓冲液3.1.4.1 提取组织样 DNA 所用溶液3.1.4.2 琼脂糖电泳所用的有关试剂3.1.4.3 PCR-SSCP 分析所用溶液3.1.4.4 转化克隆所用的相关试剂3.1.5 仪器设备3.1.6 方法3.1.6.1 马基因组DNA 的提取及检测3.1.6.1.1 马血样DNA 的提取方法3.1.6.1.2 马组织样DNA 提取方法3.1.6.1.3 DNA 质量的检测、纯化及浓度计算3.1.6.1.3.1 琼脂糖凝胶电泳检测DNA3.1.6.1.3.2 分光光度法检测DNA3.1.6.1.3.3 DNA 的纯化3.1.6.2 PCR 引物设计3.1.6.3 西南 mtDNA D-loop 部分区段 PCR 扩增3.1.6.3.1 反应混合液的组成3.1.6.3.2 PCR 反应的条件3.1.6.3.3 PCR 产物的检测3.1.6.4 西南马 mtDNA D-Loop 区段的 PCR-SSCP 分析3.1.6.4.1 10%（49∶1）非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备及电泳3.1.6.4.2 聚丙烯酰胺凝胶的银染3.1.6.5 西南马 mtDNA D-Loop 区段不同单倍型分析3.1.6.6 西南马 mtDNA D-Loop 区段不同单倍型的纯化与回收3.1.6.7 大肠杆菌 DH5α 感受态细胞的制备3.1.6.8 PCR 回收产物与载体的连接3.1.6.9 连接产物的转化3.1.6.10 白菌落转化子的重组质粒筛选鉴定3.1.6.11 重组质粒PCR 鉴定3.1.6.12 重组质粒的测序3.1.6.13 序列分析3.2 结果与分析3.2.1 西南马基因组 DNA 及 mtDNA D-loop 部分片段 PCR 扩增3.2.2 重组质粒鉴定与测序3.2.3 PCR-SSCP 分析3.2.4 西南马 mtDNA D-Loop 部分片段的单倍型多样性3.2.4.1 单倍型分布和频率3.2.4.2 测序结果3.2.4.3 不同类型马 mtDNA D-Loop 的核苷酸变异及组成分析3.2.4.4 不同类型的马 mtDNA D-Loop 部分片段各单倍型间的距离3.2.4.5 分子变异分析3.2.4.6 不同类型马聚类分析3.3 讨论3.3.1 关于PCR-SSCP 技术3.3.2 mtDNA 单倍型的分布特征3.3.3 西南马不同类型间的遗传分化3.3.4 西南马不同类型马 mtDNA D-Loop 的核苷酸组成与变异3.3.5 西南马遗传资源的保护3.3.6 西南马与蒙古马、普氏野马的关系3.3.7 中国西南马的母系起源3.4 小结4 西南马mtDNA ND3、ND4、ND4L 基因多态性研究4.1 材料4.2 方法4.2.1 DNA 的提取与分离4.2.2 琼脂糖凝胶电泳检测DNA4.2.3 分光光度法检测DNA4.2.4 DNA 扩增及其扩增产物的琼脂糖检测4.2.4.1 PCR 反应程序4.2.4.2 PCR 反应所用引物4.2.4.3 引物溶液的配制4.2.4.4 PCR 产物的检测4.2.5 聚丙烯酰胺凝胶的制备、电泳、染色和图象分析4.2.6 马 mtDNA 各位点 PCR 产物纯化回收以及测序4.2.6.1 PCR 产物纯化4.2.6.2 PCR 产物回收4.2.6.3 PCR 纯化产物测序4.2.7 统计分析4.2.7.1 用SAS 统计分析软件计算各品种马基因型与体尺的相关性4.2.7.2 测序序列的编辑4.2.7.3 多重序列比较4.2.7.4 进化树构建4.2.7.5 网络聚类分析4.3 结果与分析4.3.1 马基因组DNA 提取与检测4.3.2 马线粒体DNA ND4 基因（上游）PCR-SSCP 结果和序列分析4.3.2.1 ND4 亚基上游PCR 扩增结果4.3.2.2 ND4 亚基上游PCR-SSCP 分析4.3.2.3 ND4 亚基上游基因型与体尺的相关分析4.3.2.4 ND4 亚基上游序列分析4.3.2.4.1 序列的核苷酸变异4.3.2.4.2 碱基组成4.3.2.4.3 密码子使用频率与偏倚4.3.3 马线粒体DNA 的ND4 基因（下游）PCR-SSCP 结果和序列分析4.3.3.1 ND4 亚基下游PCR 扩增结果4.3.3.2 ND4 亚基下游PCR-SSCP 分析4.3.3.3 ND4 亚基下游基因型与体尺的相关分析4.3.3.4 ND4 亚基下游序列分析4.3.3.4.1 序列的核苷酸变异4.3.3.4.2 碱基组成4.3.3.4.3 密码子使用频率与偏倚4.3.4 马线粒体DNA 的ND4L 基因PCR-SSCP 结果和序列分析4.3.4.1 ND4L 基因PCR 扩增结果4.3.4.2 ND4L 基因PCR-SSCP 分析4.3.4.3 ND4L 亚基基因型与体尺的相关分析4.3.4.4 ND4L 基因序列分析4.3.4.4.1 序列的核苷酸变异4.3.4.4.2 碱基组成4.3.4.4.3 密码子使用频率与偏倚4.3.5 马线粒体 DNA 的 ND3 和 Ctyb 基因 PCR-SSCP 结果和序列分析4.3.5.1 ND3 基因PCR-SSCP 结果4.3.5.1.1 ND3 基因PCR 扩增结果4.3.5.1.2 ND3 基因PCR-SSCP 分析4.3.5.2 Ctyb 基因 PCR-SSCP 结果4.3.5.2.1 Ctyb 基因 PCR 扩增结果4.3.5.2.2 Ctyb 基因扩增产物的 PCR-SSCP 分析4.3.6 MT2、MT3 和MT4 三对引物所扩增片段单倍型分布4.3.7 西南马品种遗传结构分析4.3.7.1 ND4 基因序列单倍型分析4.3.7.2 种群遗传多样性、品种间DNA 差异4.3.7.3 群体间的遗传分化和遗传距离（Kimura 2-parameter,ts+tv,组间平均）4.3.7.4 系统进化树4.3.7.5 网络聚类结果4.4 讨论4.4.1 关于实验方法4.4.1.1 基因组DNA 的提取4.4.1.2 PCR 扩增条件摸索4.4.1.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳条件的摸索4.4.2 ND4 基因作为分子遗传标记在马系统发育关系研究中的探讨4.4.3 NADH 脱氢酶亚基基因密码子使用偏倚和碱基替换模式4.4.4 ND4、ND4L 扩增片段氨基酸替换情况分析4.4.5 ND3 和 ctyb 基因部分片段的多态分析4.4.6 中国西南马 mtDNA 遗传多样性和种群遗传结构4.4.7 关于NADH 脱氢酶亚基序列变异网络聚类结果的讨论4.4.8 保护和管理建议4.4.9 需要进一步研究和解决的问题4.5 小结5 西南马矮小基因的克隆与分析5.1 材料与方法5.1.1 实验材料5.1.1.1 样品来源5.1.1.2 主要试剂5.1.1.3 仪器设备5.1.1.4 主要试剂和溶液的配制5.1.2 实验方法5.1.2.1 基因组DNA 的提取与检测5.1.2.2 PCR 反应5.1.2.2.1 引物设计与合成5.1.2.2.2 PCR 反应体系的建立及反应条件的优化5.1.2.2.3 PCR 反应的程序5.1.2.3 马SHOX 基因的克隆与测序5.1.2.3.1 PCR 产物的纯化5.1.2.3.2 PCR 产物的回收（DNA 凝胶回收试剂盒）5.1.2.3.3 PCR 回收产物与 pTA2 载体的连接5.1.2.3.4 大肠杆菌 DH5α感受态细胞的制备:CaCl2 法5.1.2.3.5 感受态效价测定5.1.2.3.6 转化5.1.2.3.7 重组质粒筛选和鉴定5.1.2.3.8 重组质粒DNA 的提取（碱裂解法）5.1.2.3.9 重组质粒的PCR 鉴定5.1.2.3.10 阳性克隆的测序5.1.2.4 PCR-SSCP 分析5.1.2.4.1 马SHOX 基因PCR-SSCP 的两个位点的选择及引物设计5.1.2.4.2 PCR 反应体系的建立及反应条件的优化5.1.2.4.3 PCR 反应的程序5.1.2.4.4 马SHOX 基因的PCR-SSCP 分析5.1.3 基因多态性的统计方法5.1.3.1 等位基因频率5.1.3.2 群体 Hardy-weinberg 平衡状态的检验5.1.3.3 遗传纯合度（Homozygosity,Ho）5.1.3.4 遗传杂合度（Heterozygosity,He）5.1.3.5 有效等位基因数（Effective number of alleles,Ne）5.1.3.6 多态信息含量（Polymorphism Information Content,PIC）5.2 结果与分析5.2.1 马基因组DNA 的提取与检测结果5.2.2 PCR 扩增目的基因5.2.3 扩增产物的克隆及重组质粒的筛选和鉴定5.2.3.1 目的片段的回收5.2.3.2 重组质粒的鉴定5.2.4 测序结果5.2.5 向数据库提交马SHOX 基因序列5.2.6 西南马SHOX 基因核苷酸序列分析5.2.6.1 西南马SHOX 基因序列的比较分析5.2.6.2 不同类群马SHOX 基因核苷酸变异分析5.2.6.3 SHOX 基因核苷酸组成分析5.2.6.4 SHOX 基因密码子核苷酸组成分析5.2.6.5 SHOX 基因编码的氨基酸序列分析5.2.7 PCR-SSCP 结果5.2.7.1 P1 位点的PCR-SSCP 分析5.2.7.1.1 引物P1 的PCR 扩增结果5.2.7.1.2 P1 位点的PCR-SSCP 分析5.2.7.2 P2 位点的PCR-SSCP 分析5.2.7.2.1 引物P2 的PCR 扩增结果5.2.7.2.2 P2 位点的PCR-SSCP 分析5.2.7.2.3 序列分析与比较5.2.7.2.4 不同类型马 SHOX 基因P2 位点PCR-SSCP 的基因型5.2.7.2.5 不同类型马 SHOX 基因P2 位点PCR-SSCP 的等位基因5.2.8 西南马SHOX 基因的遗传多态性分析5.2.8.1 各群体的 Hardy-Weinberg 平衡检验5.2.8.2 SHOX 基因的杂合度、有效等位基因数和多态信息含量5.3 讨论5.3.1 动物矮小性状的遗传基础5.3.2 矮小性状基因SHOX 定位5.3.3 SHOX 基因的作用机理5.3.4 西南马矮小性状基因序列结构及与群体遗传结构分析5.4 小结创新点致谢参考文献附录作者简介
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