论文题目: 牛分枝杆菌主要保护性抗原基因的克隆、表达及免疫研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 预防兽医学
作者: 姜秀云
导师: 何昭阳
关键词: 牛结核病,牛分枝杆菌,保护性抗原基因,原核表达,疫苗,基因免疫
文献来源: 吉林农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 牛结核病(Bovine tuberculosis)主要是由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)引起的一种人兽共患传染病,该病的流行与传播不仅严重地影响着畜牧业的持续发展,而且也严重地威胁和危害着人类的生命与健康,被国际兽疫局(OIE)列为B类传染病。人结核病的10%以上是由牛分枝杆菌引起的。近年来,人结核病在世界范围内大幅回升,每年死亡人数高达300万,是其它传染病死亡人数之和,当属传染病之魁首。由于牛结核病的存在,致使人结核病最终无法根除。近年来,牛结核病在全球范围内也呈上升趋势,尤其是在广大的发展中国家流行严重,我国牛结核的阳性检出率为10%左右。在牛结核病的预防上,目前唯一可用的疫苗就是卡介苗(BCG),但是接种BCG后免疫效果不确定,同时还干扰牛PPD的变态反应检测,无法区别是自然感染还是人工免疫,给日常检疫工作带来了相当的困难。因此研发牛结核病的新型诊断和预防制剂已成为控制牛结核病的研究热点。 结核分枝杆菌是细胞内寄生菌,机体抵抗结核分枝杆菌的感染主要依靠细胞免疫。研究发现,结核分枝杆菌培养滤液中存在的大量分泌蛋白能有效地诱发对结核分枝杆菌的抵抗性,产生免疫保护作用,因此分泌蛋白是保护性抗原。DNA疫苗能有效地刺激机体产生持久的体液免疫和细胞免疫应答,而且DNA疫苗在细胞内表达的蛋白抗原通过MHC I类分子呈递抗原,激活CTL及杀灭靶细胞是DNA疫苗发挥保护作用的最主要机制之一,这正是抗结核感染所必需的。另有研究指出,DNA疫苗免疫后,不干扰结核病的变态反应检测。为了研制牛结核病敏感、特异的诊断试剂和新型、高效的预防制剂,尤其是DNA疫苗,本研究进行了以下几方面的工作: 1、牛分枝杆菌主要保护性抗原基因的克隆筛选了M. bovis Ag85A、Ag85B、MPB51、MPB63、MPB70、MPB83和ESAT-6七种分泌蛋白的保护性抗原基因。以M. bovis Vallee111染色体DNA为模板,以Ag85A、Ag85B、MPB51、MPB63、MPB70、MPB83和ESAT-6成熟蛋白基因特异性引物进行PCR扩增,分别扩增出888bp、858bp、801bp、390bp、492bp、603bp和288bp的DNA片段。通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pGEM-T Vector中,以α-互补法、质粒大小鉴定、酶切鉴定、PCR鉴定及序列分析鉴定重组克隆,成功地构建出克隆质粒pGEM-T-85A、pGEM-T-85B、pGEM-T-51、pGEM-T-63、pGEM-T-70、pGEM-T-83、pGEM-T-ESAT-6。序列测定及同源性分析表明,所获得的M. boris Vallee111成熟蛋白基因与M. bovis中其它菌株相应基因具有高度的同源性。 2、主要保护性抗原基因的原核表达 为了获得M. bovis七个保护性抗原基因的表达产
论文目录:
中文摘要
英文摘要
前言
文献综述
1 牛结核病的危害
2 流行病学
3 牛分枝杆菌的基因分型研究
4 结核分枝杆菌的致病机理
5 结核分枝杆菌的免疫机理
6 牛结核病的诊断
7 牛分枝杆菌分子生物学研究
8 牛结核病疫苗的研究
第一部分 牛分枝杆菌主要保护性抗原基因的克隆及序列分析
1 引言
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 菌株
2.1.2 克隆载体
2.1.3 工具酶
2.1.4 核酸分子量标准
2.1.5 试剂盒
2.1.6 试剂
2.1.7 溶液
2.1.8 主要仪器设备
2.2 方法
2.2.1 牛分枝杆菌的培养
2.2.2 染色体基因组DNA的提取
2.2.3 引物的设计与合成
2.2.4 目的基因的PCR扩增
2.2.5 PCR产物的纯化
2.2.6 目的基因与质粒载体的连接
2.2.7 大肠杆菌感受态的制备
2.2.8 连接产物的转化
2.2.9 质粒的小量提取
2.2.10 重组质粒的鉴定
2.2.11 重组质粒的序列测定
3 结果
3.1 牛分枝杆菌染色体基因组DNA
3.2 目的基因的PCR扩增产物
3.3 重组克隆的筛选及鉴定
3.4 目的基因的序列测定与分析
4 讨论
4.1 目的基因的来源
4.2 目的基因的选择
4.3 目的基因的序列分析
5 小结
第二部分 牛分枝杆菌主要保护性抗原基因在大肠杆菌中的表达
1 引言
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 菌株
2.1.2 质粒与载体
2.1.3 工具酶
2.1.4 核酸分子量标准
2.1.5 蛋白质分子量标准
2.1.6 试剂盒
2.1.7 试剂
2.1.8 蛋白印迹转移膜
2.1.9 溶液
2.1.10 主要仪器设备
2.2 方法
2.2.1 原核重组表达质粒的构建
2.2.2 重组表达质粒的鉴定
2.2.3 目的基因的诱导表达
2.2.4 表达产物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
2.2.5 表达产物的Western blot分析
2.2.6 表达蛋白的可溶性分析
2.2.7 包涵体的制备
2.2.8 目的蛋白的纯化
2.2.9 蛋白质的纯度鉴定与含量测定
3 结果
3.1 原核重组表达质粒的构建
3.2 阳性重组表达质粒的鉴定
3.3 SDS-PAGE分析
3.4 Western blot分析
3.5 蛋白质的可溶性分析
3.6 包涵体的制备与目的蛋白的纯化
3.7 纯化蛋白质的浓度
4 讨论
4.1 表达体系的选择
4.2 包涵体的制备
4.3 目的蛋白的纯化
4.4 目的蛋白的活性
5. 小结
第三部分 牛分枝杆菌主要保护性抗原基因真核表达载体的构建及表达
1 引言
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 菌株
2.1.2 细胞株
2.1.3 质粒与表达载体
2.1.4 工具酶
2.1.5 核酸分子量标准
2.1.6 试剂盒
2.1.7 主要试剂
2.1.8 溶液
2.1.9 主要仪器设备
2.2 方法
2.2.1 真核表达质粒的构建
2.2.2 重组表达质粒的筛选
2.2.3 重组表达质粒的大量提取
2.2.4 质粒的定量与纯度鉴定
2.2.5 重组质粒转染BHK-21
2.2.6 目的基因在BHK-21中的表达鉴定
3 结果
3.1 真核表达质粒的构建
3.2 重组表达质粒的鉴定
3.3 质粒的含量和纯度
3.4 荧光抗体检测
3.5 RT-PCR鉴定结果
4 讨论
4.1 表达质粒的选择
4.2 脂质体介导法转染
4.3 目的蛋白表达的检测
5 小结
第四部分 牛分枝杆菌主要保护性抗原基因对实验动物的免疫研究
1 引言
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 真核表达质粒
2.1.2 实验动物
2.1.3 主要试剂
2.1.4 溶液
2.1.5 主要仪器设备
2.2 方法
2.2.1 重组表达质粒的大量制备与纯化
2.2.2 重组表达质粒的定量与纯度鉴定
2.2.3 实验动物免疫
2.2.4 免疫小鼠血清中特异性抗体的检测
2.2.5 免疫豚鼠变态反应检测
2.2.6 细胞免疫检测
3 结果
3.1 重组表达质粒的纯度
3.2 免疫小鼠血清中特异性抗体的水平
3.3 免疫小鼠淋巴细胞转化试验
3.4 免疫小鼠CD4~+ T、CD8~+ T细胞数量
3.5 豚鼠变态反应检测
4 讨论
4.1 重组表达质粒的纯度
4.2 免疫接种途径、方法及剂量
4.3 免疫小鼠血清中特异性抗体的水平
4.4 免疫小鼠的细胞免疫应答
4.5 免疫豚鼠的变态反应
5 小结
结论
参考文献
缩略语表
致谢
作者简介
发布时间: 2006-01-04
参考文献
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