醇脱氢酶的催化性质和应用研究

论文摘要

醇脱氢酶（ADH）是含锌金属酶,存在于动物、植物及微生物细胞中,催化生物体内伯醇的氧化和醛的还原。在医学分析上,为诊断肝细胞坏死的特异性指标。近年来,随着有机相催化和膜反应器的发展,该酶的应用研究非常活跃。主要包括以下几个方面:作为生物传感器用于分析乙醇浓度;作为催化剂用于化工中生产原料及中间反应物;作为实验材料用于酶固定化、新型解酒剂等。因此,ADH已经成为研究热点之一而应用于医学分析和工业生产等方面。本论文分为四个部分。第一章概述了ADH所受抑制作用的机理,乙醇的定量分析方法及固定化酶的理论知识和应用研究。第二章探讨了抑制剂对ADH催化反应的影响。基于ADH催化乙醇和氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的反应,在最佳酶反应条件下,研究了Cd2+和SCN-1对酶催化的抑制作用。通过加入金属离子络合剂乙二胺四乙酸二钠（EDTA）进行了干扰消除实验,结果表明可有效的消除一定浓度的Cd2+对ADH酶促反应的干扰。考察了Cd2+和SCN-1对ADH荧光光谱的影响,发现其对ADH有荧光静态猝灭现象。用同步荧光技术研究了Cd2+和SCN-1与ADH的相互作用。第三章研究了酶催化动力学荧光法测定乙醇,利用ADH催化乙醇和NAD的反应: C2H5OH + NAD→CH3CHO + NADH,通过测定还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）荧光强度的变化率得出其酶促反应速度,对应系列乙醇溶液制得标准曲线,从而可测定试样中的乙醇含量,用该法测定了小牛血清和饮料中的乙醇,结果满意。第四章研究了壳聚糖固定化ADH的制备及酶学性质。以壳聚糖微球作为载体,戊二醛作为交联剂,通过共价结合对ADH进行固定化。讨论了戊二醛浓度,联酶时间,pH值等对ADH固定化的影响。对游离及固定化ADH酶学性质的研究表明,酶促反应的最适pH分别为8.4和8.8,最适温度分别为31℃和26℃,对乙醇的表观米氏常数分别为28.2mmol/L和8.1mmol/L。与游离酶相比,固定化酶的热稳定性更佳,并具有较好的贮存稳定性和复用性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 抑制剂对酶的作用
• 1.2 乙醇测定方法综述
• 1.2.1 碘量滴定法
• 1.2.2 气相色谱法
• 1.2.3 密度瓶法
• 1.2.4 分光光度法
• 1.2.5 高效液相色谱法
• 1.2.6 近红外光谱法
• 1.2.7 生物传感器法
• 1.2.8 酶分析法
• 1.3 荧光分析法简介
• 1.4 固定化酶简介
• 1.4.1 酶的固定化方法
• 1.4.1.1 吸附法
• 1.4.1.2 交联法
• 1.4.1.3 包埋法
• 1.4.1.4 化学共价法
• 1.4.2 固定化酶的应用
• 1.5 本论文的研究意义
• 1.6 本论文研究的主要内容
• 第二章 抑制剂对醇脱氢酶催化性质的影响
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 仪器及试剂
• 2.2.2 实验方法
• 2.3 结果和讨论
• 2.3.1 酶反应条件实验
• 2+和 SCN^-1存在下的 ADH 动力学反应'>2.3.2 Cd²⁺和 SCN^-1存在下的 ADH 动力学反应
• 2.3.3 抑制类型试验
• 2+的抑制类型'>2.3.3.1 Cd²⁺的抑制类型
• -1的抑制类型'>2.3.3.2 SCN^-1的抑制类型
• 2.3.4 镉离子干扰的消除
• 2+和 SCN^-1对 ADH 的荧光猝灭作用'>2.3.5 Cd²⁺和 SCN^-1对 ADH 的荧光猝灭作用
• 2+和 SCN^-1存在下 ADH 的同步荧光'>2.3.6 Cd²⁺和 SCN^-1存在下 ADH 的同步荧光
• 2.3.7 结论
• 第三章 酶催化动力学荧光法测定乙醇
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 仪器及试剂
• 3.2.2 实验方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 NADH 荧光光谱
• 3.3.2 试剂用量和pH值的影响
• 3.3.3 共存组分的影响
• 3.3.4 标准曲线
• 3.3.5 试样测定及加标回收试验
• 第四章 壳聚糖固定化醇脱氢酶的制备及其酶学性质
• 4.1 引言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 仪器和试剂
• 4.2.2 实验方法
• 4.2.2.1 壳聚糖载体的制备
• 4.2.2.2 ADH 的固定化
• 4.2.2.3 酶活力及乙醇浓度的测定
• 4.3 结果和讨论
• 4.3.1 壳聚糖载体的表征
• 4.3.2 固定化条件试验
• 4.3.2.1 联酶时间对酶固定化的影响
• 4.3.2.2 溶液pH 值对酶固定化的影响
• 4.3.2.3 戊二醛浓度对酶固定化的影响
• 4.3.2.4 溶液离子强度对酶固定化的影响
• 4.3.3 酶学性质
• 4.3.3.1 温度和pH值对酶活力的影响
• 4.3.3.2 米氏常数 K的测定
• 4.3.3.3 酶的热稳定性
• 4.3.3.4 酶的贮存稳定性
• 4.3.3.5 固定化酶的复用性
• 4.3.4 固定化酶体系用于试样的测定
• 4.3.4.1 标准曲线
• 4.3.4.2 试样测定及加标回收试验
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 附录 A 攻读硕士学位期间发表的论文目录