论文摘要
从本实验室保存的蛙虹彩病毒（Ranivirus）RGV（Rana grylio virus）的基因组中,克隆出一个预测可能是膜蛋白的基因MMP （Myristylated membrane protein）,运用病毒学技术、免疫学技术和分子生物学技术,对MMP基因进行特征分析。根据与RGV同源性很高的FV3相应基因设计引物从RGV基因组中克隆出全长1038bp的MMP基因,对其测序并使用几种软件进行分析。MMP基因最大的ORF长972bp,编码323个氨基酸,分子量为35kDa,氨基酸序列与同属的其它病毒相应蛋白的同源性高达91-99%,预测氨基酸序列有一个跨膜区。对MMP基因进行原核表达,得到分子量为53 kDa的缺失跨膜区的融合蛋白表达产物,制备出抗体。通过亚细胞定位和Western blot等实验初步证实MMP基因编码膜蛋白。
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中文摘要英文摘要第一章 文献综述1.1 虹彩病毒的特性和分类1.2 蛙虹彩病毒的复制1.2.1 病毒的吸附、进入和脱壳1.2.2 病毒DNA的复制1.2.3 病毒的转录及翻译1.2.4 病毒的装配与释放1.3 蛙虹彩病毒与宿主细胞的相互作用1.4 病毒蛋白的特性1.5 病毒膜蛋白的特性及功能1.6 病毒膜蛋白的体外表达1.7 本研究的背景及研究目的实验材料第二章 蛙虹彩病毒RGV9506 MMP 基因的克隆及序列分析2.1 方法2.1.1 MMP 基因的克隆及序列分析2.1.2 PCR 片断的回收与载体连接2.1.3 转化感受态细胞2.1.4 阳性克隆的筛选及MMP 基因的序列测定2.1.5 序列同源性、多序列比对分析及遗传进化树的绘制2.2 结果2.2.1 RGV9506 MMP 基因的扩增2.2.2 MMP 序列及翻译2.2.3 蛋白同源性及多重序列比对结果2.2.4 跨膜结构域的预测2.2.5 系统进化树分析结果2.3 讨论第三章 蛙虹彩病毒RGV9506 MMP 基因的特征分析3.1 方法3.1.1 原核表达载体的构建3.1.1.1 PCR扩增MMP基因3.1.1.2 酶切3.1.1.3 连接3.1.1.4 质粒的提取3.1.2 MMP 原核表达及鉴定3.1.3 抗血清的制备3.1.3.1 蛋白制备3.1.3.2 蛋白纯化3.1.3.3 免疫3.1.4 Western blot 分析3.1.5 RGV MMP蛋白在细胞内分布的检测3.1.6 Western blot分析病毒MMP蛋白3.1.6.1 病毒纯化3.1.6.2 Western blot分析3.1.7 RT-PCR检测MMP基因及Western blot分析3.1.7.1 RNA 的提取3.1.7.2 RT-PCR 扩增MMP基因3.1.7.3 Western blot 分析3.1.8 药物抑制蛋白合成和病毒DNA 复制的实验3.1.9 真核表达分析3.1.9.1 重组真核表达质粒的构建3.1.9.2 重组真核表达质粒在FHM 细胞中的表达3.2 结果3.2.1 PCR 扩增MMP 基因3.2.2 构建的原核重组质粒3.2.3 诱导表达结果3.2.4 Western blot 分析结果3.2.5 MMP蛋白在细胞内分布的检测3.2.6 Western blot分析病毒MMP蛋白3.2.7 MMP 基因时序表达的RT-PCR 和Western Blot 分析3.2.8 药物抑制蛋白合成和病毒DNA 复制的实验3.2.9 真核表达分析3.2.9.1 PCR 扩增MMP 基因3.2.9.2 构建的真核重组质粒3.2.9.3 MMP 基因在FHM 细胞中的表达3.3 讨论小结参考文献致谢
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