论文摘要
本试验对河南部分地区水牛、肉牛和奶牛隐孢子虫病进行了广泛的流行病学调查,对部分牛源隐孢子虫分离株进行卵囊形态鉴定,巢式PCR检测和PCR-RFLP分析,基于核糖体小亚基（18S rRNA）基因的种类与基因型分析,鉴定出河南部分地区牛源隐孢子虫分离株种类、基因型,确定本地区牛源隐孢子虫分离株和其它种类隐孢子虫之间的分子种系进化关系,为预防隐孢子虫病提供理论依据。为掌握河南信阳地区水牛隐孢子虫的流行动态,我们在鸡公山地区采集散养水牛粪便样品257份,经饱和蔗糖溶液和改良抗酸染色法检测,结果显示隐孢子虫总感染率为16.73%（43/257）。依据形态学数值初步鉴定为出2种隐孢子虫即微小隐孢子虫（C.parvum）和安氏隐孢子虫（C.andersoni）。其中微小隐孢子虫为人兽共患隐孢子虫种类,其感染率为0.78%（2/257）,2个C.parvum分离株均在1岁多的水牛粪便样品发现。由于本次调查的水牛常在河边放养,这对当地的水源安全构成了威胁。利用饱和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法对4个肉牛场208份河南南乐县肉牛粪便进行隐孢子虫病流行病学调查,结果发现隐孢子虫总感染率为4.32%（9/208）。根据显微镜观察,初步鉴定感染肉牛的隐孢子虫只有1种:安氏隐孢子虫。为了详细了解肉牛源隐孢子虫的遗传特征多样化情况,利用巢式PCR扩增9个肉牛源隐孢子虫分离株18S rRNA基因部分序列,进行PCR-RFLP分析和基于18S rRNA基因种系发育分析,结果表明本次分离于肉牛的9个隐孢子虫分离株均为安氏隐孢子虫（C.andersoni）。在本课题组对奶牛隐孢子虫研究的基础上,针对奶牛养殖集中的郑州、开封、济源和鹤壁4个地区9个奶牛场采集12月龄以内的奶牛粪便样品582份,经饱和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法检测,结果显示隐孢子虫总感染率为26.12%（152/582）。其中,断奶前犊牛（5日龄至2月龄）隐孢子虫感染率为30.91%（51/165）,断奶后（3月龄至12月龄）感染率为24.22%（101/417）。依据形态数值初步鉴定为2种隐孢子虫即微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫。其中微小隐孢子虫为人兽共患隐孢子虫种类,在断奶前奶牛中的感染率为50.98%（26/51）,在断奶后奶牛中为9.90%（10/101）。本次调查发现微小隐孢子虫具有较高的感染率,确定了奶牛隐孢子虫的重要公共卫生意义;同时还发现断奶前犊牛不同饲养方式对2种隐孢子虫感染率有显著影响。本试验利用巢式PCR扩增19个隐孢子虫分离株18S rRNA基因特异片段,PCR产物进行测序,产物序列长度均为837bp;用限制性内切酶Ssp I和Vsp I对PCR产物进行消化酶切确定种类和基因型。Ssp I酶切结果:2个隐孢子虫分离株酶切后产生110bp、265bp、420-430bp三个片段,17个隐孢子虫分离株酶切产生380-400bp、440-460bp ;VspI酶切结果:2个隐孢子虫分离株酶切后产生100-110bp、600-630bp两个片段,2个隐孢子虫分离株酶切后产生110-180bp、440-470bp两个片段,15个隐孢子虫分离株酶切后产生110-120bp、720-740bp两个片段;根据酶切片段初步确定这2个隐孢子虫分离株为牛隐孢子虫（C.bovis）,2个隐孢子虫分离株为隐孢子虫鹿基因型（Cryptosporidium cervine genotype）,15个隐孢子虫分离株为安氏隐孢子虫（C.andersoni）。基于种系发育关系分析确定河南部分地区奶牛源隐孢子分离株的种类或基因型,利用巢式PCR对19个隐孢子虫分离株进行18S rRNA基因特定片段扩增,并对扩增片段进行测序,测序后的序列用Blast或Fasta在NCBI、EMBL和DDBJ三大核酸序列数据库搜索同源序列,然后利用Clustal X1.81、Phylip3.65和DNAstar4.0等生物学软件对序列进行比对、构建分子进化树以及同源性分析。根据在18S rRNA基因位点种系进化关系分析,表明2个奶牛源隐孢子虫分离株为牛隐孢子虫（C.bovis）,2个隐孢子虫分离株为隐孢子虫鹿基因型（Cryptosporidium cervine genotype）,15个隐孢子虫分离株为安氏隐孢子虫（C.andersoni）。本次从奶牛体内分离出2个隐孢子虫鹿基因型分离株尚属首次,而隐孢子虫鹿基因型能够感染包括人在内的多种哺乳类动物,这为进一步研究隐孢子虫鹿基因型的生物学特性等提供了重要的参考资料。
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