烟草NtFAD2基因的沉默及功能研究

论文题目: 烟草NtFAD2基因的沉默及功能研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 植物学

作者: 杨明峰

导师: 许亦农

关键词: 烟草,油酸,基因沉默,温度

文献来源: 中国科学院研究生院（植物研究所）

发表年度: 2005

论文摘要: 油酰磷脂酰胆碱去饱和酶(FAD2)是一种重要的植物脂肪酸去饱和酶,位于内质网中,催化油酸生成亚油酸。亚油酸等多不饱和脂肪酸含量过高的植物油脂不稳定,易氧化,不易贮藏,而且氧化产物对人体有害。因此油脂改良的一个重要目的是提高种子油脂的油酸含量,降低多不饱和脂肪酸含量。另外,关于FAD2的结构、功能和表达调控等问题目前还不清楚,有待深入研究。近年发展起来的RNAi技术可有效地沉默目标基因,研究植物FAD2基因沉默后膜脂和油脂的变化及温度对基因沉默的影响,有助于深入理解FAD2酶的功能、表达调控方式和有效地利用基因沉默技术改变膜脂组成、提高植物油脂品质。本研究的主要目的是,首先采用RNAi技术抑制烟草FAD2基因(NtFAD2)的表达以降低NtFAD2酶活性,得到膜脂不饱和度改变的烟草转基因株系。然后研究NtFAD2基因沉默后脂肪酸去饱和过程的变化及其机理,以及温度对NtFAD2基因沉默的影响。研究中首先用PCR方法克隆烟草NtFAD2基因,用其编码区的一个片段构建表达发卡RNA的沉默结构,用农杆菌介导的方法转化烟草,从第一代转基因植株中筛选出油酸含量高的突变体。然后对其中一个转基因株系S61进行脂肪酸分析,发现叶片总脂和质体外单脂PC和PE中的油酸含量大幅度增加。此外,NtFAD2基因沉默对叶片甘油脂的影响有多效性,即质体内的单脂油酸含量也有显著增加,有些单脂中软脂酸含量有所下降。烟草NtFAD2基因沉默后,在叶片和种子中油酸含量变化最大,说明NtFAD2基因在不同器官中的沉默效果不同:沉默结构对NtFAD2酶活性较高的器官抑制程度更大,内源基因没有表现均一的沉默效果。沉默植株的多种组织中NtFAD2基因的mRNA降解程度相似,说明油酸含量与NtFAD2转录本的丰度没有直接关系。植物脂肪酸的不饱和程度受温度调控,因此研究FAD2基因沉默株系的油酸含量受温度影响情况及其调控规律对RNAi技术在油脂改良方面的实际应用具有十分重要的意义。研究结果表明,随着生长温度的下降,野生烟草叶片膜脂油酸含量降低,多不饱和脂肪酸含量随之增加; 转基因烟草中油酸和多不饱和脂肪酸有相似的变化趋势,但是变化幅度远远大于野生烟草。低温下转基因烟草叶片油酸含量之所以大幅度下降,其中一个重要原因是被抑制的NtFAD2酶受低温的调节而活性升高。然而研究发现,与常温条件下相比,低温下转基因烟草NtFAD2基因的mRNA丰度不变,说

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Abstract

第一章 文献综述

1 去饱和酶的研究进展

1.1 去饱和酶的研究概况

1.2 去饱和酶的种类

1.3 去饱和酶的结构特点

1.4 植物细胞的脂肪酸去饱和作用

1.5 去饱和酶与温度胁迫的关系

2 FAD2 的研究进展

2.1 FAD2 的性质

2.2 活性调节

2.3 FAD2 的多基因多拷贝现象

2.4 FAD2 功能缺失对生物膜的影响

3 RNA 干扰技术的发展和在植物中的应用

3.1 RNA 干扰技术的发展

3.2 RNA 干扰技术的作用机制

3.3 转录后基因沉默技术在植物中的应用

3.4 RNAi 技术优势和存在的问题

4 实验的目的和意义

第二章 材料与方法

1 实验材料

1.1 植物材料

1.2 引物

1.3 质粒

1.4 菌株

2 实验方法

2.1 植物总DNA 的微量提取(SDS 法)

2.2 植物总DNA 的大量提取(CTAB 法)

2.3 植物总RNA 的提取

2.4 植物SiRNA 的提取

2.5 RNA 的变性凝胶电泳

2.6 Northern 印迹

2.7 质粒DNA 的微量提取(碱裂解法)

2.8 大肠杆菌感受态细胞的制备

2.9 大肠杆菌的转化

2.10 普通PCR 扩增

2.11 cDNA 第一条链的反转录合成

2.12 玻璃奶法回收DNA 片段

2.13 离心柱法回收DNA 片段

2.14 酶切与连接

2.15 根癌农杆菌感受态细胞制备(小量)

2.16 农杆菌细胞转化(三亲交配法)

2.17 农杆菌双元载体中mini-Ti 质粒提取

2.18 烟草的遗传转化

2.19 膜脂的提取、分离及脂肪酸组成分析

2.20 Southern 印迹

第三章 烟草NtFAD2 基因的克隆和沉默表达载体的构建

1 材料和方法

1.1 NtFAD2 基因的克隆

1.2 PCR 产物的亚克隆

1.3 序列分析

1.4 烟草NtFAD2 沉默载体的构建策略

2 结果

2.1 烟草NtFAD2 基因克隆

2.2 烟草NtFAD2 沉默表达载体的构建

3 讨论

第四章 转基因烟草的鉴定

1 前言

2 结果

2.1 产物鉴定

2.2 分子生物学鉴定

2.3 遗传学鉴定

3 讨论

第五章 烟草NtFAD2 基因沉默对脂肪酸去饱和的影响

1 前言

2 结果

2.1 烟草叶片总脂

2.2 烟草叶片单脂

2.3 烟草不同器官的脂肪酸含量的变化

3 讨论

第六章 温度对烟草NtFAD2 沉默效应的影响

1 前言

2 结果

2.1 不同生长温度下烟草叶片总脂中油酸的含量随着处理时间的变化

2.2 烟草充分伸展的叶片总脂中油酸的含量与生长温度的关系

2.3 烟草充分伸展的叶片单脂中油酸的含量与生长温度的关系

2.4 烟草叶片在不同的温度下NtFAD2 的m RNA 变化

2.5 烟草在不同的生长温度下种子总脂中油酸的含量随时间的变化

2.6 温度对烟草叶片总脂中软脂酸含量的影响

3 讨论

总结

参考文献

博士期间论文情况

致谢

发布时间: 2006-04-30

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