重组人干扰素的基因表达以及PEG修饰

论文摘要

重组干扰素-α是一种具有抗病毒、抗繁殖和免疫调节等特性的药物蛋白,多次用于临床治疗疾病和癌症。然而,它在人体内半衰期非常短,使它不能大规模应用于临床。因此,本文通过聚乙二醇与蛋白质的化学耦合来延长干扰素-α的半衰期。利用基因定点突变在蛋白质非活性位点引进半胱氨酸残基,通过这个半胱氨酸残基将蛋白质和聚乙二醇（末端含有与半胱氨酸反应的活性基团）进行共价连接,这种方法的优点是能产生高生物活性,单一位点耦合物。由Bolder Biotechnology, nc生物技术公司构建的含有干扰素-α基因的质粒转化进大肠杆菌W3110,IPTG诱导后经SDS-PAGE分析,表达产物的分子量为19KD左右,并且蛋白以不溶性的包涵体形式存在。Western-blot印迹分析证实表达产物具有良好的免疫学活性。同时优化了蛋白表达条件,结果为:温度37℃,环境pH7.0,IPTG浓度0.5mM,诱导时间16小时。包涵体蛋白经过盐酸胍变性后稀释复性,然后利用阳离子交换色谱层析（IEC）分离得到目标蛋白,其纯度达到98%以上。同时,也对层析条件进行了优化,并最终从1L细菌培养基中得到22mg目的蛋白。最后干扰素-α与马来酰亚胺-PEG反应得到位点特异、单一的PEG化蛋白。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 干扰素的研究背景
• 1.1.1 干扰素的发现
• 1.1.2 干扰素的产生及其结构特点
• 1.1.3 干扰素的治病原理
• 1.2 蛋白质的聚乙二醇修饰
• 1.2.1 聚乙二醇的性质
• 1.2.2 PEG 修饰蛋白的应用原理
• 1.2.3 聚乙二醇的活化
• 1.3 干扰素-αPEG 修饰的研究进展
• 1.3.1 PEG-干扰素-α2a（Pegasys）
• 1.3.2 PEG-干扰素-α26（PEG-Intron）
• 1.3.3 PEG-干扰素-α（位点特异的PEG 化）
• 第二章 干扰素-α的基因表达
• 2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
• 2.1.1 试剂
• 2.1.2 仪器
• 2.1.3 操作步骤
• 2.2 质粒双酶切
• 2.2.1 质粒的提取
• 2.2.2 DNA 电泳
• 2.3 SDS-PAGE 检测目的蛋白表达
• 2.3.1 目的蛋白的诱导表达
• 2.3.2 SDS-PAGE
• 2.4 SDS-PAGE 分析蛋白表达产物
• 2.4.1 试剂
• 2.4.2 实验步骤
• 2.5 WESTERN BLOT 分析诱导表达后细菌裂解物
• 2.5.1 主要试剂及仪器
• 2.5.2 Western Blot 方法步骤
• 2.6 蛋白表达条件的优化
• 2.7 实验结果及讨论
• 2.7.1 感受态细胞的制备和转化
• 2.7.2 质粒双酶切鉴定
• 2.7.3 SDS-PAGE 检测目的蛋白表达
• 2.7.4 SDS-PAGE 分析蛋白表达产物
• 2.7.5 Western Blot 分析诱导表达后细菌裂解物
• 2.8 蛋白表达条件的优化
• 第三章 目的蛋白的分离纯化
• 3.1 包涵体的变性复性
• 3.1.1 主要试剂
• 3.1.2 实验步骤
• 3.2 阳离子交换层析
• 3.2.1 主要试剂及仪器
• 3.2.2 实验步骤
• 3.3 蛋白质的含量测定
• 3.3.1 试剂及仪器
• 3.3.2 实验步骤
• 3.4 层析的条件优化
• 3.5 实验结果与讨论
• 3.5.1 包涵体的变性复性
• 3.5.2 阳离子交换层析
• 3.5.3 蛋白质的含量测定
• 3.5.4 层析的条件优化
• 参考文献
• 发表论文和科研情况说明
• 致谢