猪囊性纤维化跨膜电导调节因子及其△F508突变体的细胞生物学和分子药理学研究

论文摘要

CFTR（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR）即囊性纤维化跨膜电导调节因子,是一种cAMP依赖的Cl-通道,广泛表达于呼吸道、胰腺、胃肠道、睾丸、汗腺和唾液腺等多种分泌型和吸收型上皮,主要参与电解质、液体转运以及调节其它膜通道蛋白的功能。其基因突变导致白种人中常见的致死性常染色体隐性遗传疾病即囊性纤维化病（cystic fibrosis,CF）。其中最为常见的突变类型是AF508（第508位氨基酸苯丙氨酸缺失）,有90%的CF病人其一条染色体都携有AF508突变。CF疾病的主要特征是反复的肺部感染、结构破坏和纤维修复,最终导致肺功能不可逆性的丧失,这也是CF疾病高发病率和致死性的主要原因。由于缺少合适的动物模型,CF发病机理并不清楚。尽管在CFTR基因克隆后,建立了许多CF小鼠转基因模型,并且这些小鼠也重现了CF病人的肠道病变。但由于小鼠与人在气道细胞生物学、粘膜下腺表达量以及小鼠气道可能存在其它的非CFTR介导的氯离子转运,CF转基因小鼠模型未能表现作为CF病人主要致死原因的肺部病变。因此,需要寻找其它的动物建立CF模型。猪在解剖学、生理学上和人有极大的相似性,比较适合建立CF动物模型。此外,由于猪具有较长的寿命,使得对于CF肺疾病的发生、治疗手段的长期治疗效果以及副作用的研究成为可能。现在很多研究者致力于构建猪CFTR基因敲除猪和AF508突变猪CF模型。但由于基因敲除猪也可能发生类似于基因敲除鼠的肠梗阻,在未发生肺部疾病前过早死亡,使后续研究难以进行。此外,我们实验室和美国Ostedgaad等的近期研究发现,猪AF508-CFTR在稳定转染细胞模型中能够正常加工成熟转运到质膜,提示猪AF508转基因模型将不会出现预期的表型。用CFTR特异性抑制剂诱导猪CF模型是另一个可行的策略。但现今发现的人CFTR特异性抑制剂CFTRinh-172对猪CFTR的亲和力差,抑制效果并不明显,并且本实验室前期研究发现,该药不能诱导猪CF模型的产生。另一种CFTR抑制剂GlyH-101虽然对猪有较好的抑制效果,但其在动物体内分布和代谢情况并不清楚,是否适合用来做药物诱导猪CF模型也不清楚。因此,需要寻找高亲和力、高特异性、在猪体内主要CF病变器官分布较高的猪CFTR抑制剂来诱导猪CF模型。本文的目的是系统研究猪△F508-CFTR的细胞生物学和电生理特征,并通过高通量筛选发现新的猪CFTR特异性、高亲和力抑制剂,为建立猪CF药理模型奠定基础。首先利用PCR方法我们获得了猪CFTR基因,并将其连入真核表达载体pcDNA3.1Zeo。对猪CFTR基因进行点突变,获得了猪△F508-CFTR,也将其连入真核表达载体pcDNA3.1Zeo。将这两个构建好的重组质粒与对碘离子敏感的绿色荧光蛋白突变体EYFP-H148Q-1152L稳定转染FRT（fisher大鼠甲状腺上皮细胞）,建立了猪CFTR高通量筛选细胞模型。利用自己制备的针对猪CFTR NBD2结构域的多克隆抗体,对瞬时及稳定转染野生型和△F508-pCFTR的Cos7细胞及FRT细胞进行免疫印记及免疫荧光分析,发现△F508-pCFTR蛋白大部分（77.8%）都具有成熟型糖基化形式,能够被正常转运上膜。通过Cl-电流荧光测定、短路电流分析以及全细胞膜片钳电流测定,发现△F508-pCFTR具有依赖于cAMP激活的Cl-转运功能。较野生型相比,△F508-pCFTR对cAMP激动剂forskolin的敏感性降低10倍（EC50 5μM vs EC50 0.5pM）;其forskolin激活的最大电流为野生型的61%;对人CFTR抑制剂CFTRinh-172和GlyH-101的灵敏性更高,1μM CFTRinh-172对△F508-pCFTR和野生型CFTR的抑制百分率分别为40%和20%。这些结果都表明猪△F508突变是一种“温和性”突变,突变蛋白能正常转运到达顶质膜,只是功能较野生型有所降低。以往的研究表明,10%的人△F508-CFTR转运到达顶质膜就可以避免CF症状的发生,因此△F508转基因猪CF模型不会出现预期表型。此外,对GlyH-101在小鼠体内的分布、代谢情况进行了初步研究,发现其在小鼠肺内分布并不明显,并很快被清除干净。据此我们推断其在猪体内也具有类似分布代谢情况,提示GlyH-101并不适合作为药物来诱导猪CF模型。因此,需要寻找对猪更有效的特异性抑制剂。利用构建的FRT/EYFP-H148Q-I152L/pCFTR稳定转染细胞模型,通过高通量筛选技术对含10万个结构多样的小分子组合化学库进行抑制剂的筛选,发现了3个新的猪CFTR特异性抑制剂。其中活性最好的PI1,能够以剂量依赖的方式抑制FRT单层上皮细胞CPT-cAMP激活的猪CFTR短路电流,其IC50为13.34μM,且这种作用具有快速、可逆、无毒的特点。在小鼠体内活性试验中,可有效抑制霍乱毒素诱导的肠道液体分泌（80%）。通过以上研究,进一步证实猪△F508突变CFTR的细胞生物学行为与人△F508-pCFTR有显著差异,提示猪△F508转基因模型将不会出现预期的表型。此外,我们对10万个小分子组合化学库筛选,发现了3个新结构的猪CFTR抑制剂,但其亲和力不高,提示我们从小分子组合化学库获得猪CFTR高亲和力的抑制剂可能性不大。下一步计划对本实验室近期从500种常用中草药建立的一个含40000个组分的小分子库进行系统筛选,从结构更为复杂多样的天然产物中寻找猪CFTR的高亲和力、特异性抑制剂。

论文目录

中文摘要

英文摘要

引言

一、研究背景和立题依据

二、本文研究内容和意义

第一章文献综述

一、CFTR离子通道的概述

（一） CFTR基因的发现与命名

（二） CFTR基因、蛋白结构

（三） CFTR的组织定位与功能

（四） CFTR的合成、转运及突变类型

二、CFTR与疾病及治疗手段

（一）囊性纤维化

（二）分泌性腹泻

（三）多囊肾病

（四）与CFTR相关疾病的治疗手段

三、大动物——猪CF模型建立的重要性和可行性

（一）小鼠CF模型的局限性

（二）猪CF模型建立的可行性及策略

第二章实验材料与方法

一、实验材料

（一）主要生化和分子生物学试剂

（二）细胞系

（三）实验动物

（四）质粒及载体

（五）主要设备

二、实验方法

（一）猪CFTR cDNA的克隆及pCFTR和△F508-pCFTR真核表达载体的构建

（二） pcDNA3.1Zeo/pCFTR和pcDNA3.1Zeo/△F508-pCFTR稳定转染及瞬时转染细胞系的获得

（三）猪CFTR抗体的制备及猪CFTR蛋白表达分析

（四） pCFTR和△F508-pCFTR氯离子通道功能荧光测定方法

（五） pCFTR和△F508-pCFTR氯离子通道功能短路电流分析

（六） pCFTR和△F508-pCFTR氯离子通道功能全细胞膜片钳测定

（七） pCFTR抑制剂的筛选

（八） pCFTR抑制剂对小鼠肠道液体分泌抑制活性分析

（九） pCFTR小分子抑制剂的化学合成

第三章结果与分析

第一部分猪CFTR和猪AF508-CFTR细胞生化特征分析及功能测定

一、猪CFTR cDNA的克隆及pCFTR和△F508-pCFTR真核表达载体的构建

二、猪CFTR抗体的制备及猪CFTR蛋白表达分析

三、pCFTR和△F508-pCFTR功能测定

第二部分猪CFTR抑制剂的筛选及活性研究

一、CFTR抑制剂GlyH101在小鼠体内的组织分布

二、猪CFTR特异性抑制剂的筛选原理

三、猪CFTR抑制剂的活性研究

四、猪CFTR抑制剂的作用动力学研究

五、猪CFTR抑制剂对稳定转染pCFTR的FRT上皮细胞短路电流的抑制

六、猪CFTR抑制剂毒性分析

七、猪CFTR抑制剂小鼠体内活性研究

八、pCFTR小分子抑制剂的化学合成及活性分析

第四章讨论

一、猪△F508-CFTR的特殊性

二、猪CFTR抑制剂在建立猪囊性纤维化模型和治疗仔猪分泌性腹泻中的应用

结论

主要创新点

参考文献

主要英文缩写词表

致谢

作者简历

在学期间公开发表论文及著作情况

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