论文题目: 辅助因子促进蛋白质复性的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 生物化工
作者: 董晓燕
导师: 赵学明
关键词: 溶菌酶,复性,折叠辅助因子,色谱
文献来源: 天津大学
发表年度: 2005
论文摘要: 蛋白质的体外复性研究不仅对基因工程重组蛋白质的生产具有重要意义,而且对探索蛋白质错误折叠导致疾病的机理也具有积极的指导作用。本文以变性还原溶菌酶为模型蛋白质,研究了不同折叠辅助因子对促进蛋白质复性的作用;复性动力学特性;以及辅助因子与色谱耦合作用提高蛋白质复性收率的途径。首先研究了分子伴侣,固定化分子伴侣以及固定化分子伴侣色谱辅助蛋白质复性特性。结果表明,在1 mol/L的最佳盐酸胍浓度下,固定化分子伴侣色谱法的最高复性收率可达到97%,复性产率达到54 mg/L.h,是尺寸排阻色谱法的4倍,证明固定化分子伴侣色谱复性方法在高通量复性方面具有明显的优势。为了解明分子伴侣辅助蛋白质复性的动力学特性,建立了分子内折叠与分子间聚集的竞争反应动力学模型。模型分析表明,分子伴侣的存在可有效抑制聚集体的生成,降低聚集体反应级数(为2级反应);三磷酸腺苷(ATP)作为多肽链释放驱动剂是十分重要的,GroEL和ATP的同时作用可提高复性速率2倍以上;在一定的酶浓度下,添加适当GroEL和ATP浓度,可实现蛋白质的高收率和高速度复性。其次研究了人工伴侣系统,即十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)+β-环糊精(β-CD)促进高浓度变性溶菌酶的复性作用。结果表明,人工伴侣系统的辅助复性收率较直接稀释的自发复性提高约70%,比仅有β-CD存在下的复性提高约40%。动力学分析表明,人工伴侣存在下聚集体的生成为三级反应,与直接稀释复性相同;盐酸胍和人工伴侣的作用都是抑制聚集体的生成,并且两者具有协同作用,利用此协同效应,可使高浓度的酶(1mg/mL)获得高收率复性(>80%)。此外,若有人工伴侣的存在,在较低浓度的盐酸胍条件下就可实现快速、高收率的蛋白质复性。根据上述人工伴侣辅助复性的研究成果,提出了尺寸排阻色谱与人工伴侣耦合作用促进蛋白质复性的耦合复性方法,并实验证明该方法的有效性。利用此方法,获得较高的复性收率的色谱流速高于单纯的尺寸排阻色谱,因此利用耦合色谱有利于提高蛋白质复性产率。另外,该方法还可实现连续色谱复性,因此可获得较高的产物浓度和复性收率,具有实际应用前景。最后,研究了各种简单稀释添加剂的辅助复性效果和动力学特性。证明添加剂可分为两类,一类如乙酰胺、硫脲、丙酮和精氨酸,它们与盐酸胍类似,既抑制分子间聚集,又抑制分子内折叠,因此,存在最佳浓度使复性收率最高;另一类如甘油,为天然蛋白质稳定剂,可促进分子内折叠,提高复性速率和收率。但达到一定浓度后继续增大其浓度对复性收率影响很小。
论文目录:
第一章 文献综述
1.1 蛋白质的结构及生物学活性
1.1.1 蛋白质的结构
1.1.2 蛋白质构象与功能
1.2 蛋白质的变性及其特点
1.2.1 理化因素引起的蛋白质变性
1.2.2 生物体内自身发生的蛋白质变性
1.3 蛋白质的再折叠(复性)及控制路径
1.3.1 蛋白质的折叠
1.3.2 蛋白质的折叠机理
1.3.3 折叠过程的瓶颈反应
1.4 变性蛋白质体外复性的一般方法
1.4.1 分子伴侣辅助蛋白质复性
1.4.2 人工伴侣辅助蛋白质复性
1.4.3 色谱辅助蛋白质复性
1.4.4 稀释添加技术辅助蛋白质复性
1.5 变性蛋白质的复性动力学
1.6 本文研究的主要内容及目的
第二章 固定化分子伴侣GROEL 辅助溶菌酶复性
2.1 引言
2.2 实验材料及方法
2.2.1 实验材料及设备
2.2.2 主要溶液及培养基
2.2.3 实验方法
2.3 结果与讨论
2.3.1 固定化分子伴侣GroEL 辅助溶菌酶复性
2.3.2 固定化分子伴侣GroEL 辅助溶菌酶复性条件的优化
2.3.3 固定化分子伴侣GroEL 凝胶的回收利用
2.3.4 固定化GroEL 色谱辅助溶菌酶复性的研究
2.4 小结
第三章 分子伴侣GROEL 辅助溶菌酶复性动力学
3.1 引言
3.2 实验材料及方法
3.2.1 实验材料及设备
3.2.2 实验方法
3.3 结果与讨论
3.3.1 二态模型对GroEL 辅助溶菌酶复性动力学的分析
3.3.2 竞争模型对GroEL 辅助溶菌酶复性动力学的分析
3.4 小结
第四章 人工伴侣辅助溶菌酶复性
4.1 引言
4.2 实验材料及方法
4.2.1 实验材料及设备
4.2.2 实验方法
4.3 结果与讨论
4.3.1 β-环糊精的辅助复性作用
4.3.2 人工伴侣辅助变性溶菌酶复性
4.3.3 盐酸胍与人工伴侣的协同辅助复性作用
4.3.4 人工伴侣辅助复性的动力学
4.4 小结
第五章 人工伴侣与尺寸排阻耦合色谱辅助溶菌酶复性
5.1 引言
5.2 材料和方法
5.2.1 实验材料及设备
5.2.2 实验方法
5.3 结果与讨论
5.3.1 人工伴侣促进高浓度溶菌酶的复性
5.3.2 人工伴侣辅助复性条件的优化
5.3.3 人工伴侣与尺寸排阻色谱耦合辅助蛋白质复性
5.4 小结
第六章 小分子添加剂辅助溶菌酶复性
6.1 引言
6.2 材料和方法
6.2.1 实验材料及设备
6.2.2 实验方法
6.3 结果和讨论
6.3.1 小分子添加剂的辅助复性作用
6.3.2 小分子添加剂的辅助复性动力学
6.3.3 酰胺类添加剂对溶菌酶复性的促进作用
6.4 小结
第七章 结论与展望
7.1 结论
7.2 展望
参考文献
发表论文和科研情况说明
致谢
发布时间: 2006-05-24
参考文献
- [1].蛋白质吸附平衡和动力学理论研究[D]. 周笑鹏.天津大学2006
- [2].加压CO2-乙醇-水体系等电沉淀蛋白质过程的研究[D]. 齐祥明.浙江大学2004
- [3].表面活性剂辅助蛋白质复性过程机理研究[D]. 王君.清华大学2004
- [4].高密度糖基化聚丙烯微孔亲和膜的点击化学制备及其蛋白质分离研究[D]. 王苍.浙江大学2011
- [5].离子型聚合物的制备及在蛋白质分离中的应用[D]. 曹付虎.中国科学技术大学2013
- [6].壳聚糖改性及壳聚糖基膜色谱材料的设计与开发[D]. 刘也卓.复旦大学2012
- [7].阳离子纤维素用于毛细管电泳分离碱性蛋白质的研究[D]. 赵凌国.武汉大学2012
相关论文
- [1].新型蛋白质氧化折叠助剂的分子设计和复性方法研究[D]. 王国珍.天津大学2011
- [2].变性蛋白复性装置研制及包涵体蛋白变性和复性技术研究[D]. 冯延叶.华东理工大学2013
- [3].同电荷物质促进蛋白质复性的研究[D]. 杨春燕.天津大学2013
- [4].渗透剂对蛋白质稳定性和折叠复性的影响[D]. 刘建华.天津大学2007
- [5].溶菌酶和重组人干扰素-γ包涵体体外折叠复性的研究[D]. 高永贵.浙江大学2002
- [6].温敏型聚N-异丙基丙烯酰胺凝胶协助蛋白质体外复性的基础研究[D]. 崔志芳.浙江大学2004
- [7].基因工程药物人干扰素-γ体外重折叠复性研究[D]. 靳挺.浙江大学2004
- [8].乳酸乙酯合成的研究[D]. 高静.天津大学2005