豇豆胰蛋白酶抑制剂基因及几丁质酶基因转化欧美杨的研究

论文摘要

杨树是世界主要的造林和经济树种之一,在世界各地特别是中国均有广泛的栽培。欧美107 杨是从欧洲黑杨与美洲黑杨的杂交后代中选育出的一个无性系,具有抗逆能力强、材质好和速生等优点,它既可作为绿化树种,又可作为优质的纸浆原料,在工业用材中发挥重要作用,为目前推广的主要品系之一。几丁质酶可以将几丁质水解为N-乙酰氨基葡萄糖,大量研究表明,几丁质酶在植物体内和体外,对病原真菌的生长均有明显的抑制作用。豇豆胰蛋白酶抑制剂能抑制昆虫肠道蛋白酶活性,使昆虫生长发育缓慢,甚至死亡,具有广谱的抗虫作用。本研究选择欧美107 杨作为转基因的实验材料,研究了激素浓度等因素对其叶片的芽再生、继代、生根等方面的影响,建立了杨树高频再生体系。在此基础上,将编码豇豆胰蛋白酶抑制剂和几丁质酶的基因分别构建植物表达载体,以欧美107 杨叶片为外植体,利用改良的农杆菌介导法进行转化,获得转基因植株。具体试验结果如下: 1. 建立了欧美107 杨离体叶片的高频芽再生体系。研究结果表明,不同的激素浓度配比对欧美107 杨组培苗不同外植体的分化和生长有重要影响。通过不同激素浓度配比的实验,确定了最佳继代培养基（MS + 0.15mg/L 6-BA + 0.1mg/L IBA + 0.1mg/L KT）、叶片芽再生培养基（MS + 0.5mg/L 6-BA + 0.1mg/L IBA）和生根培养基（MS + 0.05mg/L NAA）。pH值、琼脂浓度、温度、湿度等其他物理因素对其也有影响。2. 分别进行了选择性抗生素卡那霉素与潮霉素的敏感性试验,结果表明卡那霉素（Km）20 mg/L 可作为诱导叶片芽再生临界筛选和生根时筛选抗性植株的使用浓度; Km30 mg/L 可作为继代培养筛选抗性植株的使用浓度。而潮霉素对外植体毒害很大,不宜用作欧美107 杨的筛选抗生素。3. 用改良的根癌农杆菌介导法将豇豆胰蛋白酶抑制剂（CpTI）基因导入107 杨中。经过严格的Km 筛选,得到了Km 抗性（Kmr） 植株。对部分Kmr 植株进行PCR 及PCR-Southern 杂交鉴定,证实CpTI 基因已整合到杨树基因组中。转基因植株的饲虫实验表明,部分株系的叶片可在一

论文目录

• 英文缩略表
• 中文摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 杨树的组织培养
• 1.1.1 组织培养在杨树上的应用
• 1.1.2 杨树组织培养技术
• 1.2 杨树基因工程育种
• 1.2.1 外源基因转化技术
• 1.2.2 基因工程在杨树中的应用
• 1.2.2.1 抗虫育种
• 1.2.2.2 抗病及其它
• 1.3 植物蛋白酶抑制剂研究进展
• 1.3.1 植物蛋白酶抑制剂的作用与分类
• 1.3.2 植物蛋白酶抑制剂在基因工程中的应用
• 1.4 几丁质酶研究进展
• 1.4.1 植物几丁质酶的特性
• 1.4.2 几丁质酶与植物的防卫反应机制
• 1.4.3 植物转几丁质酶基因工程的研究
• 1.5 选题依据
• 1.5.1 转化基因的选择
• 1.5.2 植物受体的选择
• 1.5.3 基因转化方法的选择
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 昆虫材料
• 2.1.3 菌株与质粒
• 2.1.4 细菌培养基
• 2.1.5 植物激素和植物培养基
• 2.1.5.1 植物激素
• 2.1.5.2 植物培养基
• 2.1.6 试剂
• 2.1.6.1 抗生素
• 2.1.6.2 植物基因组 DNA 提取液
• 2.1.6.3 大肠杆菌质粒提取液
• 2.1.6.4 提取农杆菌双元载体质粒试剂
• 2.1.6.5 电泳缓冲液配制
• 2.1.6.6 Southern 杂交试剂
• 2.1.6.7 GUS 染色液的配制
• 2.1.7 酶与生化试剂
• 2.1.8 PCR 引物
• 2.1.9 仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 欧美107 杨高频再生体系的建立
• 2.2.1.1 组培苗的初步获得
• 2.2.1.2 最佳激素培养体系的确立
• 2.2.1.2.1 单一激素敏感性试验
• 2.2.1.2.2 激素对叶片芽分化的影响
• 2.2.1.2.3 激素对茎尖生长的影响
• 2.2.1.3 组培苗根的诱导
• 2.2.2 农杆菌介导法转基因
• 2.2.2.1 CpTI 基因的转化
• 2.2.2.2 几丁质酶基因的转化
• 2.2.3 抗生素筛选
• 2.2.3.1 抑菌性抗生素（头孢霉素）敏感性试验
• 2.2.3.2 选择性抗生素（卡那霉素、潮霉素）敏感性试验
• 2.2.4 转化植株的分子检测
• 2.2.4.1 大肠杆菌 DH5α感受态细胞的制备及转化
• 2.2.4.2 碱法提取少量质粒DNA
• 2.2.4.3 提取农杆菌双元载体质粒
• 2.2.4.4 植物基因组 DNA 的提取
• 2.2.4.5 PCR 检测
• 2.2.4.6 PCR-Southern 检测
• 2.2.5 GUS 基因稳定表达的组织化学染色
• 2.2.6 抗虫生物活性测试
• 3 结果与分析
• 3.1 欧美107 杨高频再生体系的建立
• 3.1.1 最佳激素培养体系的确立
• 3.1.1.1 单一激素的影响
• 3.1.1.2 激素对叶片芽再生的影响
• 3.1.1.3 激素对茎尖生长的影响
• 3.1.1.4 激素对根的诱导
• 3.1.2 其他理化因素的影响
• 3.1.3 玻璃化问题的解决
• 3.1.4 苗龄对107 杨生长和分化的影响
• 3.2 农杆菌介导的遗传转化体系的初步建立
• 3.2.1 转CpTI 基因抗虫植株的获得
• 3.2.1.1 卡那霉素（Km）选择压的确定
• 3.2.1.2 抑菌性抗生素的选择
• 3.2.1.3 叶片的预培养
• 3.2.1.4 卡那抗性植株的获得
• 3.2.1.5 Km抗性植株的分子生物学鉴定
• 3.2.1.6 转基因植株的室内饲虫试验
• 3.2.2 几丁质酶基因的转化
• 3.2.2.1 潮霉素（Hyg）对欧美107 杨的影响
• 3.2.2.2 GUS 染色筛选转化植株
• 4. 讨论
• 4.1 欧美 107 杨基因转化受体系统的建立
• 4.2 多价基因的转化
• 4.3 单基因的多功能
• 4.4 下一步工作设想
• 5. 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文