苯二氮卓类药物残留免疫分析方法的研究

论文摘要

本研究旨在研究快速检测苯二氮卓类（BZD）的间接酶联免疫（ELISA）方法和竞争性胶体金免疫层析方法。实验选择了硝西泮（NZP）、氯硝西泮（CZP）和地西泮（DZP）作为研究对象,首先对三种物质分别进行衍生化,合成相应的半抗原;再将半抗原分别与牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）和卵清白蛋白（ovalbumin,OVA）交联,制备成免疫抗原和包被抗原;将得到的免疫原免疫新西兰白兔,每种免疫原免疫2只兔子,5次免疫后测定每只兔子抗血清的效价,并选择效价高的血清供后面实验用。设计了检测NZP的间接竞争ELISA方法,并优化稀释缓冲液、pH、竞争时间等实验条件确定最终的ELISA检测系统。该间接竞争ELISA方法的IC50为1.531 ng/mL,LOD为0.081 ng/mL,检测范围在0.1713.8 ng/mL,NZP尿样中的回收率在62.8%85.6%之间,相对标准偏差低于5.67%,抗NZP的抗体对分子结构相似的氯硝西泮,地西泮和2种代谢物7-氨基硝西泮、7-氨基氯硝西泮都具有交叉反应,但对其他类镇静类药物如盐酸异丙嗪等则具有较好的特异性,交叉反应率均≤0.1%。本研究还设计了检测NZP竞争性胶体金免疫层析试纸条,采用柠檬酸三钠还原法制备了18.6 nm左右的胶体金溶液。在标记NZP多克隆抗体时,最佳pH值为9,最适标记抗体浓度为20μg/mL。选用Millipore公司的M135硝酸纤维膜,上海金标有限公司的VL78玻璃纤维膜为金标垫,SB06玻璃纤维膜为样品垫,吸水纸,PVC底板组装成试纸条。其中每金标垫上喷涂60μL金标抗体,检测线和质控线分别用0.5 mg/mL的NZP包被抗原和0.2 mg/mL的羊抗兔IgG二抗。用试纸条检测NZP标准溶液,检测限为150 ng/mL。本研究所建立的检测NZP的间接ELISA方法的各项参数都达到了国外试剂盒的指标和要求,可用于实际检测;本研究的胶体金免疫层析试纸条实验为NZP胶体金试纸条的深入研究提供了重要的实验依据,也对食品中其它小分子兽药残留检测试纸条的研制提供了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 苯二氮卓类概论
• 1.1.1 苯二氮卓类的理化性质
• 1.1.2 BZD 的药理性质
• 1.2 BZD 的残留与危害
• 1.3 BZD 残留的仪器检测技术
• 1.3.1 样本前处理
• 1.3.2 气相色谱法（GC）
• 1.3.3 高效液相色谱法（HPLC）
• 1.3.4 高效薄层色谱（HPTLC）
• 1.4 BZD 残留的免疫检测技
• 1.4.1 免疫检测的原理
• 1.4.2 酶联免疫吸附测定（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）
• 1.4.3 胶体金免疫分析检测技术
• 1.5 本课题研究内容、目标
• 1.5.1 研究内容
• 1.5.2 研究目标
• 第二章 苯二氮卓类免疫原的合成与鉴定
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 试剂
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 溶液系统
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 免疫原的合成
• 2.2.2 包被原的合成
• 2.2.3 衍生物的鉴定
• 2.2.4 免疫原和包被原的鉴定
• 2.3 结果
• 2.3.1 衍生物的鉴定
• 2.3.2 免疫原的鉴定
• 2.4 讨论
• 2.4.1 载体的选择
• 2.4.2 交联方法的选择
• 2.4.3 最佳交联数目
• 2.5 本章小结
• 第三章 苯二氮卓类抗体的制备、纯化与鉴定
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 试剂
• 3.1.2 主要仪器设备
• 3.1.3 溶液系统
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 多克隆抗体的制备
• 3.2.2 抗血清的分离与保存
• 3.2.3 抗血清的纯化
• 3.2.4 采用间接ELISA 法测定抗血清的效价
• 3.3 结果
• 3.3.1 抗血清纯化的结果分析
• 3.3.2 间接ELISA 法测定抗血清效价的结果分析
• 3.4 讨论
• 3.5 本章小结
• 第四章 ELISA 方法检测苯二氮卓类残留的建立
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 药品和试剂
• 4.1.2 主要仪器设备
• 4.1.3 溶液系统
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 NZP 的间接竞争ELISA（Competitive indirect ELISA, ic-ELISA）方法的建立
• 4.2.2 ic-ELISA 各参数的优化
• 4.2.3 ic-ELISA 方法评估
• 4.3 结果
• 4.3.1 ic-ELISA 各参数的确定
• 4.3.2 ic-ELISA 方法评估
• 4.4 讨论
• 4.4.1 ELISA 试剂盒条件的优化
• 4.4.2 ic-ELISA 的评估
• 4.5 小结
• 第五章 胶体金免疫分析方法的研究
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 试剂
• 5.1.2 主要仪器设备
• 5.1.3 试纸条材料
• 5.1.4 溶液系统
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 胶体金的制备[55]
• 5.2.2 胶体金标记抗体蛋白
• 5.2.3 试纸条制备材料的选择
• 5.2.4 溶液系统的筛选
• 5.2.5 试纸条的组装
• 5.2.6 试纸条的测试方法
• 5.2.7 试纸条灵敏度测试
• 5.2.8 重复性测试
• 5.2.9 稳定性测试
• 5.3 结果
• 5.3.1 胶体金的质量鉴定
• 5.3.2 胶体金标记抗体蛋白
• 5.3.3 溶液系统的筛选
• 5.3.4 试纸条的组装
• 5.3.5 试纸条灵敏度测试
• 5.3.6 重复性测试
• 5.3.7 稳定性测试
• 5.4 讨论
• 5.4.1 胶体金的制备
• 5.4.2 胶体金的标记
• 5.5 本章小结
• 第六章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文