RSV感染后中性粒细胞TLR4表达与功能研究

论文摘要

研究背景呼吸道合胞病毒（RSV）为副粘病毒科肺炎病毒属、有包膜、非节段性的单负链RNA病毒。作为引起婴幼儿下呼吸道感染最重要和常见的病毒病原体,RSV感染呼吸道上皮细胞后,诱导产生大量细胞因子、趋化因子、活性氧等活性介质,导致婴幼儿喘息性疾病的发生。近年来发现Toll样受体（TLR）在抗病原微生物免疫防御反应中起重要作用,通过识别细菌、病毒和环境中相应抗原的保守结构,启动天然免疫应答,TLR在联系天然免疫和获得性免疫中起桥梁作用。以往研究大多集中在探讨TLR在细菌感染中的作用,随着研究的深入,TLR在病毒感染中的作用日益受到关注。其中,TLR4通过识别RSV融合蛋白（F）蛋白,在RSV感染的发生发展中起着重要作用。我们的研究结果证实RSV感染后气道上皮细胞TLR4表达增加,增加了上皮细胞对随后的环境刺激因素如脂多糖（LPS）的敏感性,明显增强炎症反应。RSV引起的呼吸道感染患儿气道聚集大量中性粒细胞,在清除病原微生物的同时也导致了自身细胞的损伤和死亡。中性粒细胞表达除TLR3以外所有的TLRs。研究证实TLR4表达对中性粒细胞的聚集、黏附、凋亡、细胞因子或趋化因子以及活性氧产生起重要调控作用。迄今为止尚没有治疗RSV感染的特效药,采用糖皮质激素尤其是地塞米松（Dexamethasone,DEX）治疗RSV引起的喘息性疾病存在争议。一方面,DEX可下调心、肺组织及单核细胞TLR4表达,抑制NF-κB活性及TNF-α等炎症因子产生,促进中性粒细胞凋亡发挥抗炎作用保护机体,另一方面, DEX改变Thl/Th2细胞偏移,促进Th2发育,可能加重变态反应性炎症。目前尚未见DEX对RSV感染后中性粒细胞TLR4表达、炎症因子分泌以及杀菌功能影响的相关研究报道。本研究拟从RSV感染对中性粒细胞TLR4表达与功能影响,进一步探讨RSV感染免疫发病机理,体外观察DEX对RSV感染后中性粒细胞TLR4表达及功能的影响,为寻找防治RSV感染后气道炎症产生的新方法提供理论依据。第一部分RSV对中性粒细胞TLR4表达及功能影响目的探讨RSV感染后中性粒细胞TLR4表达及IL-6、IL-8和H2O2水平变化,进一步明确TLR4信号通路在中性粒细胞功能发挥中的作用。方法取健康体检儿童全血,分离中性粒细胞,设: RSV感染组、TLR4阻断组及对照组。其中:RSV感染组加入RSV病毒悬液共同培养,TLR4阻断组预先加入TLR4阻断剂HTA125培养0.5h后再加入RSV病毒悬液共同培养,对照组用培养基或生理盐水代替RSV悬液进行实验。采用流式细胞仪检测中性粒细胞表面TLR4表达,及H2O2产生,培养18h后离心收集上清液,采用ELISA方法检测中性粒细胞产生IL-6和IL-8水平。结果（1） RSV感染后,TLR4阳性中性粒细胞为28.798±5.266%较对照组TLR4阳性中性粒细胞（17.476±5.853%）明显增高;中性粒细胞IL-6和IL-8的表达均明显增加,RSV感染组IL-6和IL-8分别为466.03±36.478 pg/ml和1528.96±72.55 pg/ml,明显高于对照组（IL-6:21.205±15.059 pg/ml;IL-8:399.34±267.45pg/ml）;RSV感染后中性粒细胞产生H2O2为105.223±9.633MFI,较对照组（H2O2:39.004±1.30MFI）明显增加。（2）阻断中性粒细胞TLR4信号传导,RSV感染诱导的IL-6产生减少（阻断组IL-6:391.307±43.45pg/ml;RSV感染组IL-6:466.03±36.478 pg/ml）,中性粒细胞产生H2O2增加（阻断组H2O2:116.787±12.059 MFI;RSV感染组H2O2:105.223±9.633 MFI）,IL-8产生没有显著影响。结论RSV感染可上调中性粒细胞TLR4表达,诱导IL-6、IL-8及H2O2产生,TLR4信号通路影响RSV感染后中性粒细胞IL-6和H2O2产生。第二部分地塞米松对RSV感染中性粒细胞TLR4表达及功能影响目的地塞米松（DEX）治疗RSV感染引起的喘息性疾病的有效性存在争议。动物模型证实DEX可通过影响中性粒细胞功能发挥抗炎作用,保护肺组织。本研究旨在探讨DEX对RSV感染后中性粒细胞TLR4表达,细胞因子IL-6、IL-8分泌以及H2O2产生的影响,并施以阻断剂干预,阐明DEX对中性粒细胞的作用与TLR4信号通路的关系,为DEX的应用提供理论依据。方法取健康体检儿童全血,分离中性粒细胞,计数,分成五组:RSV组、DEX组、RSV+DEX组、RSV+DEX+HTA125组及对照组。RSV组加入RSV病毒悬液共同培养,DEX组只加入DEX, RSV+DEX组加入DEX和RSV病毒悬液共同培养,RSV+DEX+HTA125组预先加入HTA125培养0.5h后再加入RSV病毒悬液和DEX共同培养,对照组用培养基或生理盐水代替RSV悬液进行实验。同时,以布地奈德（BUD）作为不同激素对照进行上述试验。1h后流式细胞仪检测中性粒细胞TLR4表达,2h后流式细胞仪检测中性粒细胞H2O2产生,18h后离心收上清液ELISA试剂盒检测中性粒细胞分泌的IL-6、IL-8。结果（1） DEX下调RSV感染后中性粒细胞TLR4表达:RSV+DEX组TLR4阳性中性粒细胞为23.572±4.191%较RSV组TLR4阳性中性粒细胞（28.798±5.266%）明显降低;（2） DEX显著减少RSV感染的中性粒细胞产生IL-6、IL-8和H2O2:RSV+DEX组IL-6、IL-8和H2O2分别为377.86±12.51pg/ml、724.976±56.82pg/ml和89.22±11.32 MFI,明显低于RSV组（IL-6:557.60±3.34 pg/ml;IL-8:1089.558±28.57 pg/ml;H2O2:105.22±9.63MFI）。BUD下调RSV感染后中性粒细胞TLR4表达,减少IL-6产生,但对IL-8和H2O2没有影响。（3）阻断TLR4,DEX对RSV感染中性粒细胞诱导产生IL-6的抑制作用进一步增强,逆转DEX对RSV感染中性粒细胞H2O2产生的抑制作用:RSV+DEX+HTA125组IL-6 （238.42±15.37pg/ml）较RSV+DEX组IL-6 （252.016±10.116pg/ml）减低; RSV+DEX+HTA125组H2O2 （101.575±13.9MFI）较RSV+DEX组H2O2 （89.219±11.32MFI）增加。阻断中性粒细胞TLR4对BUD作用没有影响。结论DEX下调RSV感染后中性粒细胞TLR4表达,抑制中性粒细胞的功能,减轻炎症反应,阻断TLR4可协同DEX发挥抗炎作用,逆转DEX抑制中性粒细胞吞噬杀伤作用。

论文目录

• 符号说明
• 摘要
• ABSTRACT
• RSV 感染后中性粒细胞TLR4 表达与功能研究
• 第一部分 RSV 对中性粒细胞TLR4 表达及功能影响
• 前言
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 第二部分 地塞米松对RSV 感染中性粒细胞TLR4 表达及功能影响
• 前言
• 1. 材料
• 2. 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 文献综述
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表论文