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霍乱毒素A、B亚单位对HIV-1调节/辅助基因DNA疫苗的佐剂效应研究

2020-12-17阅读(902)

霍乱毒素A、B亚单位对HIV-1调节/辅助基因DNA疫苗的佐剂效应研究

论文摘要

人免疫缺陷病毒I型（Human Immunodeficiency Virus Type I, HIV-1）感染可以导致获得性免疫缺陷综合症（acquired immunodeficiency syndrome, AIDS）,即艾滋病。艾滋病已成为有史以来最具破坏性的传染病之一:目前全球共存活艾滋病病毒感染者和病人（HIV/AIDS）约3340万人。在我国艾滋病的流行状况也非常严峻:2009年当年中国新发艾滋病病毒感染者就有4.8万人,病情发展的速度已是全球最快的国家之一。流行病学调查显示我国HIV-1最主要的流行亚型或流行重组型是CRF07BC, CRF08BC, B’（泰国B）和CRF01AE。其中AE重组型病毒主要通过性接触途径传播,感染比例每年在大幅度上升,约占总流行率的50%。以往的研究提示:T细胞疫苗所活化的免疫反应广度对疫苗效果具有重要影响。为了提高HIV-1候选DNA疫苗所活化的T细胞反应广度,本实验室在以往的研究中设计、构建了表达HIV-1 AE2f tat-rev-intergrase（c-half）-vif-nef融合基因（TRIVN）的DNA疫苗。然而,在小鼠免疫实验中我们发现TRIVN融合基因疫苗的免疫原性并不理想,其所活化的特异性T细胞反应强度远远低于HIV-1 Env等结构蛋白。为了提高TRIVN融合基因DNA疫苗的免疫原性,本研究以霍乱肠毒素（Cholera toxin, CT）、A亚单位（CTA）及B亚单位（CTB）为佐剂,通过CTA/CTB蛋白与TRIVN融合基因DNA疫苗混合免疫和构建CTA/CTB-TRIVN融合DNA疫苗两种方式探讨上述两种佐剂对TRIVN免疫原性的改善作用。本研究共分三步进行:第一步,CTA和CTB的表达纯化。霍乱肠毒素是引起霍乱的主要致病因子,由—个A亚单位（CTA）和5个相同的B亚单位（CTB）组成,是一种很强的免疫原和粘膜免疫佐剂。但是,天然分离纯化的CTA和CTB蛋白由于分离的技术问题导致纯化出的蛋白会因彼此相互掺杂而影响最后对蛋白功能的判定,因而天然纯化的蛋白难以有效地研究其佐剂特性的具体机制。国内多项研究显示,CTA/CTB在大肠杆菌中的表达一直比较困难,而目前能表达出的是pET-32a基础上的额外增加20KDa的TRx标签的蛋白,对于蛋白功能的研究存在一定的影响。为此,我们摸索了CTA和CTB的表达纯化条件,通过氯霉素的加入,成功构建了pET-30a-CTA及pET-30a-CTB原核表达载体,并诱导表达出了具有活性的19KD的CTB和30 KD的CTA蛋白。第二步,通过两种方式观察佐剂效应,第一种是CTA/CTB蛋白与TRIVN融合基因DNA疫苗混合免疫。为了评价上述表达纯化的CTA和CTB与DNA疫苗混合后活化的免疫反应特征,我们用已构建好的TRIVN DNA疫苗配伍CTA、CTB或CT,肌肉注射免疫小鼠4次,最后一次免疫两周后处死小鼠进行检测。基于IFN-γ检测的ELISPOT实验显示,就总T细胞反应强度来看,对照AE-TRIVN（520±120 SFCs/106splenocytes）均低于AE-TRIVN+CT组（658±170 SFCs/106 splenocytes）, AE-TRIVN+CTA组（692±220 SFCs/106 splenocytes）,AE-TRIVN+CTB组（734±270 SFCs/106 splenocytes）。此外,虽然组间比较没能达到统计学意义上的显著性,但AE-TRIVN所激发的总T细胞反应强度在混合入CT或者CTA或者CTB之后,免疫反应都在一定程度上得到提高。说明CT及其亚单位与TRIVN疫苗简单混合的方式免疫,免疫原性的改善不够显著,在配伍的形式上还需进一步优化。接下来,我们进一步考虑第二种方式:构建CTA/CTB-TRIVN融合基因疫苗并观察其免疫原性。考虑到常规的方法如:酶切连接进而在载体上不断插入新的序列,这样的方法由于在共表达蛋白之间添加了多余的碱基而有可能发生误读,且费时费力,效率也不高。为了能够准确无误地表达以上融合蛋白,我们首次利用overlap pcr方法,将TRIVN基因和人源化的CTA或CTB基因进行融合,经基因测序证实成功构建了pSV1.0-TRIVN-CTA和pSV1.0-TRIVN-CTB。免疫结果显示:从总T细胞反应强度来看,AE-TRIVN-CTB活化的T细胞免疫反应为1548±330 SFCs/106脾细胞,显著高于AE-TRIVN活化的710.25±310 SFCs/106脾细胞（p<0.05）,并且AE-TRIVN-CTA所活化的T细胞免疫反应为1642±514 SFCs/106脾细胞,相较于AE-TRIVN组也具有统计学意义（p<0.05）。实验结果表明,所表达纯化的CTA、CTB蛋白为今后进行动物体内实验研究其佐剂效果提供了研究基础。AE-TRIVN与CTA或CTB进行基因融合相较简单的混合形式更能有助于改善AE TRIVN DNA疫苗的免疫原性,以上结论则进一步揭示了霍乱肠毒素基因具有在动物体内作为HIV DNA疫苗的佐剂的潜在应用价值。

论文目录

  • 中文摘要
  • Abstract
  • 序言
  • 参考文献
  • 第一部分 霍乱毒素A、B 亚单位的克隆表达
  • 1 实验材料
  • 1.1 菌株、细胞和质粒
  • 1.2 工具酶和主要生化试剂
  • 1.3 试剂盒和抗体
  • 1.4 培养基和实验用溶液
  • 1.5 主要仪器
  • 2 实验方法
  • 2.1 重组质粒pET30a-CTA、pET30a-CTB 的构建
  • 2.2 BL21（DE3）中蛋白大量表达的诱导方法及表达产物的初步分析
  • 2.3 CTB 蛋白的GM1 结合能力检测
  • 3 实验结果
  • 3.1 重组质粒的PCR、酶切鉴定与测序
  • 3.2 pET-30a-CTA /CTB 重组质粒的诱导表达及鉴定
  • 4. 讨论
  • 参考文献
  • 第二部分 CTA/CTB 蛋白配伍TRIVN DNA 疫苗的佐剂效果评价
  • 1. 实验材料
  • 1.1 质粒
  • 1.2 蛋白
  • 2. 实验方法
  • 2.1 动物免疫
  • 2.2 免疫小鼠脾淋巴细胞的收集与处理
  • 2.3 细胞免疫反应的检测
  • 2.4 统计学方法
  • 3 实验结果
  • 3.1 ELISPOT 检测免疫后小鼠T 细胞反应
  • 4 讨论
  • 参考文献
  • 第三部分 CTA/CTB 融合TRIVN DNA 疫苗的佐剂效果评价
  • 1 实验材料
  • 1.1 菌株、细胞和质粒
  • 1.2 工具酶和主要试剂
  • 2 关键实验方法
  • 2.1 融合DNA 疫苗的构建
  • 2.2 293T 细胞的转染
  • 2.3 Western-Blot 方法验证蛋白表达
  • 2.4 动物免疫
  • 2.5 免疫小鼠脾淋巴细胞的收集与处理
  • 2.6 细胞免疫反应的检测
  • 2.7 统计学方法
  • 3 实验结果
  • 3.1 重组DNA 质粒pSVAE-TRIVN-CTA、pSVAE-TRIVN-CTB 的构建与鉴定
  • 3.2 重组DNA 质粒pSVAE-TRIVN-CTA、pSVAE-TRIVN-CTB 的体外表达验证
  • 3.3 不同重组TRIVN DNA 疫苗免疫原性的比较
  • 4. 讨论
  • 参考文献
  • 结论
  • 文献综述： 霍乱毒素佐剂应用研究进展
  • 参考文献
  • 攻读学位期间本人出版或公开发表的论著、论文
  • 本研究所获基金资助
  • 附录
  • 缩略词表
  • 致谢

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