同种异体脱细胞气管基质移植的研究

论文摘要

目的：长段气管缺损之后的形态与功能重建，是困扰临床医师多年的难题。随着同种异体器官移植研究的发展，同种异体气管移植逐渐被视为长段气管重建的较为理想的方法。但是，宿主对同种异体气管的免疫排斥以及移植段气管的再血管化是现代气管移植研究尚未解决的两个难题。我们分别应用改良的Courtman气管黏膜脱细胞方法以及程序深低温冻存方法对同种异体气管段进行处理，并将处理过的气管段进行原位移植，对移植效果进行观察。以期寻找一种较为有效的降低同种异体气管免疫原性的方法，为长段气管缺损后形态与功能重建提供一种新思路。方法：本实验用Beegle犬共分为三组：A组为新鲜气管移植组（n=5）、B组为冷冻气管移植组（n=5）和C组为改良的Courtman方法黏膜脱细胞气管基质移植组（n=5）。新鲜移植组：新鲜同种异体气管未经处理，直接行原位移植；冷冻气管移植组：移植段气管经程序降温后，先放入-196℃的液氮中冷冻保存6周，再复温后原位移植；改良的Courtman方法气管黏膜脱细胞处理移植组：先经非离子型表面活性剂Triton X-100、酶制剂联合处理黏膜脱细胞后再原位移植。观察指标及方法有：（1）组织学切片HE染色观察经不同方法处理后的各组气管段样本的黏膜及软骨部分光镜结构变化；（2）原位移植术后观察宿主犬的生存状况，记录咳嗽、气短出现的时间及变化，行X线摄片观察移植段气管狭窄情况。（3）气管原位移植术后，在不同时相抽取宿主犬周围静脉血，应用流式细胞仪检查淋巴细胞亚群，分析CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的变化。（4）宿主犬死亡或处死后，将气管移植段取出，观察大体改变，气管狭窄程度，组织切片HE染色观察移植段气管黏膜与软骨结构改变。结果：（1）各实验组移植段气管处理后的移植术前的光镜结构变化：新鲜气管组HE染色可见气管黏膜表面排列整齐的假复层柱状纤毛上皮细胞，黏膜及黏膜下层基质细胞、腺细胞和血管内皮细胞保存完好，软骨部分结构致密，可见软骨细胞单独或多个生长于软骨陷窝内；冷冻段气管见黏膜纤毛柱状上皮部分脱失，黏膜下层结构保存完好，软骨细胞未见明显破坏；改良的Courtman方法气管黏膜脱细胞处理组气管段样本见黏膜及黏膜下层内细胞成分完全脱失，HE染色黏膜部分仅见红染黏膜脱细胞基质，软骨细胞无明显破坏。（2）原位移植术后宿主犬生存情况观察：新鲜气管移植组宿主犬均于术后7天出现明显咳嗽，于14天左右呼吸困难较明显，行X线摄片见移植段气管狭窄超过50％，均于3周内死亡。冷冻气管移植组宿主犬约2周左右出现咳嗽等症状，呼吸稍快，4例犬术后分别于2月内死亡，X线片检查见有不同程度的狭窄。改良的Courtman方法气管黏膜脱细胞处理组宿主犬术后呼吸平稳，2月左右时有不同程度的气短，2例犬术后长期无明显临床症状，不咳、无气短等呼吸道症状，均存活至3月，X线片检查见移植段气管仅轻微狭窄。（3）各实验组不同时相周围静脉血流式细胞仪检测CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的变化：新鲜气管移植组宿主犬CD3+、CD4+T淋巴细胞数在术后第7天较术后第1天稍增加（P＞0.05），无统计学意义；CD4+／CD8+比值亦增高（P＞0.05），无统计学意义；术后14天时较第一天均显著增加（P＜0.05），有统计学意义。冷冻气管移植组宿主犬CD3+、CD4+T淋巴细胞数在术后第7天较术后第1天稍增加（P＞0.05），无统计学意义；CD4+／CD8+比值亦增高（P＞0.05），无统计学意义；术后14天时较第1天均显著增加（P＜0.05），有统计学意义。改良的Courtman方法气管黏膜脱细胞处理移植组宿主犬CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞数及CD4+／CD8+比值术后变化不明显。（4）各实验组移植术后移植段气管的大体及组织学变化：A组犬移植段气管大体观可见气管软骨软化，有的软骨环完全脱落于管腔中，管腔明显狭窄，狭窄程度超过50％，HE染色光镜结构可见纤毛上皮细胞消失，部分细胞鳞化，软骨环破坏，管腔内出现大量肉芽组织，可见大量淋巴细胞浸润，间质出血严重；B组犬移植段气管大体观可见气管软骨亦软化，管腔狭窄近50％，HE染色光镜结构可见管腔内无上皮细胞，有大量肉芽组织，有大量淋巴细胞浸润；C组犬移植段气管大体观可见气管轻微狭窄，HE染色光镜结构可见管腔内有少量肉芽组织，可见移行上皮细胞，有少量淋巴细胞浸润，软骨下可见新生血管形成，有部分钙化。结论：应用改良的Courtman方法气管黏膜脱细胞处理和深低温冻存法均能有效去除同种异体气管段的细胞抗原性，降低宿主对移植段气管的免疫排斥反应，但是改良的Courtman方法气管黏膜脱细胞处理较深低温冻存法可获得更好的效果，气管原位移植后宿主犬生存时间较长、生存质量较高。经过黏膜脱细胞处理的同种异体气管基质可望成为长段气管缺损后形态和功能重建的新的选择。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 前言
• 材料与方法
• 实验对象
• 实验仪器和试剂
• 实验方法
• 结果
• 1 各组移植前气管样本EH切片染色
• 2原位移植后宿主犬大体观察
• 3不同时相静脉血行流式细胞仪检查淋巴细胞亚群
• 4移植后气管大体及组织学观察
• 讨论
• 结论
• 附录
• 参考文献
• 综述 同种异体气管移植的研究进展
• 1同种异体气管移植免疫排斥反应问题
• 2同种异体移植的再血管化
• 3气管的保存
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文
• 学位论文评阅及答辩情况表