论文摘要
目的土槿皮是松科植物金钱松的根皮,土槿皮乙酸（pseudolaric acid B,PAB）是土槿皮主要的生物活性成分,与雷公藤总甙同属于二萜类化合物,分子式为C23H28O8。近年研究发现PAB具有抗肿瘤作用,PAB可以抑制胃癌、肺癌、结肠癌、宫颈癌及黑色素瘤等多种肿瘤细胞的增殖并诱导细胞凋亡,其作用机制可能与清除自由基,作用于细胞周期蛋白及细胞周期蛋白依赖性激酶,影响p53、Bcl-2家族、Caspase活性,影响与肿瘤发生密切相关的细胞信号传导通路等有关,但其确切机制尚不完全清楚,并可能因为细胞类型的不同而存在差异。目前,随着对细胞凋亡机制研究不断深入,线粒体在细胞凋亡中的作用受到关注,被认为是细胞凋亡的调控器。在凋亡过程中,线粒体有两个重要作用,首先它以ATP的形式提供细胞凋亡所需的能量。其次,在细胞尚未发生形态改变时,细胞内线粒体己开始了一系列活动,如线粒体跨膜电位（△ψm）降低、膜发生渗透性转换、线粒体释放凋亡特异性酶激活物细胞色素C及凋亡诱导因子（apoptosisinducing factor,AIF）等,最终决定细胞凋亡发生与否。因此,线粒体被认为是细胞凋亡的调控器。环氧化酶（cycloxygenase,COX）-2为可诱生型COX,在正常生理状态下多数组织内检测不到,当细胞受到炎症信号、某些细胞因子、促癌剂等刺激后表达增加。近年来研究表明,COX-2除在炎症反应中起重要作用外,尚与肝癌、结肠癌等肿瘤的发生密切相关。本研究观察PAB对肝癌细胞BEL-7402增殖及凋亡的影响,探讨线粒体膜电位及COX-2蛋白表达在PAB诱导细胞凋亡过程中的变化,旨在认识PAB抗肿瘤作用机制。方法1、细胞培养细胞接种在含10%胎牛血清、100U/L青链霉素的RPMI-1640培养基中,在37℃、体积分数为5%CO2、95%湿度培养箱中培养。细胞单层贴壁生长,48-72小时传代。2、MTT比色法检测细胞增殖人肝癌细胞株BEL-7402细胞密度调整为2-3×104/L,接种于96孔培养板,每孔200μL。培养12小时后分别加入含不同浓度PAB的培养液,分别培养24,48,72h,应用MTT比色法检测各孔吸光度值（OD值）,计算细胞生长抑制率。3、流式细胞仪分析细胞周期分别收集被不同浓度PAB作用24小时的肝癌细胞BEL-7402,调整细胞数约为1×106,70%乙醇4℃固定过夜。PI复合染液避光染色20min后行流式细胞仪检测。CellQuest软件获取单个细胞104个,用ModFitLT软件分析细胞周期和凋亡率。4、细胞形态学观察收集不同浓度药物作用24h后的各组细胞,制成浓度为1010cells/L的活细胞悬液,用0.1g/L吖啶橙染色,于荧光显微镜观察,摄片。5、检测线粒体膜电位（△ψm）收集不同浓度PAB作用24小时的细胞,用JC-1工作液染色,流式细胞仪（Ex=488 nm;Em=530 nm）检测△ψm的变化,并于荧光显微镜下观察,照相。6、Western blot检测COX-2蛋白表达7、统计学分析所有实验数据均采用mean±SD表示,用SPSS 13.0软件进行t检验。结果1、PAB对BEL-7402生长的抑制作用0.5,1.0,2.0,4.0μmol/L PAB对细胞作用24,48,72h,抑制细胞生长,且表现出明显的剂量依赖性和时间依赖性（P＜0.05）。2.0μmol/L PAB对BEL-7402作用72小时,抑制率接近100%。2、PAB对细胞周期和凋亡率的影响PAB对BEL-7402细胞作用24小时,随着浓度的增加,G0/G1、S期细胞逐渐减少,G2/M期细胞逐渐增多。0μmol/L PAB作用24小时,G0/G1、S、G2/M比例分别为（73.62±1.38）%、（26.28±0.83）%、（0.10±1.48）%;4.0μmol/L PAB作用24小时,G0/G1、S、G2/M比例分别为0%,（1.96±0.07）%,（98.04±1.46）%,提示PAB可使细胞周期阻滞于G2/M期（P＜0.05）。与对照组（0.1±0.08）%相比,2.0,4.0μmol/L PAB作用24小时后,细胞凋亡率明显增加,分别为（19.06±3.87）%,（31.19±1.46）%（P＜0.05）。3、细胞形态学变化（吖啶橙染色）正常细胞核结构正常、均呈绿色荧光。1.0μmol/L PAB作用24小时后,荧光显微镜下观察到典型的细胞凋亡特征性变化:凋亡细胞胞核呈固缩状的或半月形绿色荧光或橘黄色荧光。4、PAB对BEL-7402△ψm的影响该试验发现BEL-7402细胞经0.5μmol/L PAB作用24小时后,线粒体即由橘红色变为绿色。BEL-7402细胞经0,0.5,1.0,2.0,4.0μmol/L PAB作用24 h后,线粒体膜电位降低,分别是（33.46±0.87）%、（51.97±1.42）%、（63.34±2.67）%、（70.78±7.39）%、（77.62±8.13）%,提示线粒体膜电位发生去极化（P＜0.05）。5、PAB对BEL-7402 COX-2蛋白表达的影响0,0.5,1.0,2.0,4.0μmol/L PAB作用BEL-7402细胞24h,随药物浓度的增加,COX-2蛋白表达减少（P＜0.05）。1.0,2.0,4.0μmol/L PAB处理组尤为明显,较对照组相比,COX-2蛋白表达减少近50%。结论1、PAB以剂量和时间依赖的方式抑制BEL-7402生长,以剂量依赖的方式使细胞周期阻滞在G2/M期,诱导细胞凋亡。2、PAB以剂量依赖的方式降低线粒体膜电位,诱导细胞凋亡。3、PAB以剂量依赖的方式抑制COX-2蛋白表达发挥抗肿瘤作用。