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玉米愈伤组织分化的遗传分析及相关基因克隆

2020-11-23阅读(185)

玉米愈伤组织分化的遗传分析及相关基因克隆

论文摘要

愈伤组织分化出完整植株是转基因受体的最终表现形式，从数量遗传学及基因表达水平上进行研究，将获得愈伤组织分化的遗传信息，有利于拓宽玉米转基因受体种质资源。 本研究以生产上常用的18599（红）、18599（白）等21个玉米自交系为材料，筛选出6个自交系配制完全双列杂交，分别对自交系和杂交组合进行幼胚培养，统计绿苗分化数，对基因型差异、配合力效应、遗传模型和遗传效应等进行了研究。 本研究首次利用抑制性扣除杂交技术分离18599（红）愈伤组织分化相关基因。将继代三次的胚性愈伤组织转入分化培养基中，分别在24h、48h、72h三个时间段提取RNA，等量混合作为Tester样品池，取三个相应时段的分化前愈伤组织RNA，等量混合作为Driver样品池，经两次扣除杂交和两次选择性扩增，构建差减cDNA文库，经反Northern杂交确定阳性侯选克隆，简写为ZmECR。提交测序并进行Genbank序列比对，对愈伤组织分化相关的基因功能进行了讨论。对部分已知序列设计引物进行RT-PCR扩增，探索基因差异表达丰度和表达时期。 取得了如下主要研究结果： 1．基因型是影响玉米自交系和杂交组合幼胚培养绿苗分化的重要因素，筛选获得了最佳培养材料—18599（红），与其他已筛选获得的优良玉米组培材料相比，不仅自身培养效率更高，作为亲本组配的后代也表现更好而且更稳定，是玉米转基因受体系统研究获得的重大突破性材料，对它进行开发利用必将为加快我国玉米基因工程育种的进程奠定良好的物质基础。 2．杂交后代绿苗分化数分布范围较广，表明玉米愈伤组织分化是数量遗传性状，且高分化力可以通过杂交转移。因此，若要获得分化数较高的组合，至少选用一个自身表现较高的亲本。而且控制分化的基因可能为核基因遗传，亲本杂交方式对培养效率没有影响。 3．遗传模型分析的结果表明，基因加性效应与非加性效应比约为3：1，非加性效应主要为显性效应，不存在上位性效应，但可能还存在基因连锁。经估算，广义遗传力和狭义遗传力仅为41％和31％，因此，在对绿苗分化性状进行选择时，应以利用杂种优势为主，可在早代进行选择。同时，对杂交亲本进行选择时，应

论文目录

  • 论文独创性声明
  • 关于论文使用授权的声明
  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 文献综述
  • 1. 组织和细胞培养的意义及发展概况
  • 2. 幼胚培养研究意义
  • 2.1 克服杂种胚早期衰败
  • 2.2 突变体筛选
  • 2.3 用作转基因受体
  • 3. 影响玉米幼胚培养的因素
  • 3.1 基因型对幼胚培养效果的影响
  • 3.2 培养基组成和培养条件对幼胚培养过程的影响
  • 4. 组织培养遗传研究进展
  • 5. 玉米幼胚培养胚性愈伤组织分化植株的研究进展
  • 5.1 愈伤组织分化性状的重要意义
  • 5.2 愈伤组织分化的表型研究现状
  • 5.3 愈伤组织分化的传统遗传学研究
  • 5.4 愈伤组织分化的分子标记研究
  • 6. 利用 mRNA进行功能基因研究的重要性和必要性
  • 7. 差异表达基因克隆的常见方法
  • 7.1 差异显示技术（DDRT-PCR）
  • 7.2 代表性差异分析法（RDA）
  • 7.3 基因芯片
  • 7.4 抑制性差减杂交（SSH）
  • 7.4.1 SSH原理
  • 7.4.2 SSH技术的优点和缺点
  • 7.4.3 SSH在动物上的应用
  • 7.4.4 SSH在植物上的应用
  • 8. 关于愈伤组织的基因克隆研究
  • 9. 立题思想
  • 第二章 玉米幼胚培养愈伤组织分化能力遗传分析
  • 1. 实验方法与材料
  • 1.1 供试材料
  • 1.2 培养方法
  • 1.3 培养基及培养条件
  • 1.4 资料统计分析
  • 1.4.1 性状调查
  • 1.4.2 资料统计分析
  • 2. 结果与分析
  • 2.1 自交系绿苗分化数分析
  • 2.2 完全双列杂交组合绿苗分化数均值分析
  • 2.3 杂交组合绿苗分化数配合力分析
  • 2.3.1 杂交组合间绿苗分化数的差异显著性测验
  • 2.3.2 配合力方差分析
  • 2.3.3 配合力效应值及相关参数的估计及检验
  • 2.4 绿苗分化数的正反交分析
  • 2.5 用hayman法对双列杂交组合进行遗传模型和效应分析
  • 第三章 玉米幼胚培养愈伤组织分化相关基因克隆
  • 1. 材料与方法
  • 1.1 供试材料
  • 1.2 培养方法
  • 1.3 培养基及培养条件
  • 1.4 Tester和 Driver材料选取
  • 1.5 RNA提取
  • 1.6 mRNA分离纯化
  • 1.7 SSH
  • 1.8 PCR产物纯化
  • 1.9 cDNA消减文库的构建
  • 1.10 质粒提取
  • 1.11 外源插入片段的酶切鉴定
  • 1.12 外源插入片段的 PCR鉴定
  • 1.13 反Northern鉴定
  • 1.14 DNA测序与序列数据分析
  • 1.15 差异表达基因的 RT-PCR检验
  • 2. 结果与分析
  • 2.1 玉米胚性愈伤组织分化
  • 2.2 RNA提取和检测
  • 2.3 mRNA纯化
  • 2.4 抑制性消减杂交
  • 2.4.1 cDNA双链合成与 EcoRI酶切
  • 2.4.2 消减杂交与选择性 PCR
  • 2.6 质粒 DNA提取
  • 2.7 文库插入片段检测
  • 2.7.1 酶切检测插入片段
  • 2.7.2 PCR检测插入片段
  • 2.8 文库的反向-Northern杂交筛选
  • 2.9 阳性克隆测序和同源序列比对分析
  • 2.10 RT-PCR验证功能基因差异表达
  • 2.11 序列功能分析
  • 2.11.1 蛋白质合成和降解酶
  • 2.11.2 能量代谢酶
  • 2.11.3 糖代谢相关酶
  • 2.11.4 运输蛋白
  • 2.11.5 调节蛋白和酶
  • 2.11.6 其它功能
  • 附图
  • 第四章 讨论
  • 1. 玉米幼胚培养胚性愈伤组织分化的遗传多样性
  • 2. 亲本自身表现在亲本选择中的应用
  • 3. 配合力分析在亲本选择中的应用
  • 4. 遗传模型和效应在后代选择和亲本选择中的应用
  • 5. 应用SSH技术结合反向Northtern 技术克隆玉米分化相关基因
  • 6. 关于愈伤组织分化的形态建成
  • 7. 愈伤组织分化过程中的核酸、蛋白质代谢
  • 8. 愈伤组织分化过程中的糖代谢
  • 9. 培养条件诱导的愈伤组织分化基因
  • 10. 愈伤组织分化与逆境胁迫相关基因
  • 11. 愈伤组织分化相关基因表达丰度及表达时期
  • 第五章 结论
  • 第六章 进一步研究计划
  • 参考文献
  • 致谢
  • 附录1 总RNA的提取与检测
  • 附录2 MRNA纯化
  • 附录3 抑制消减杂交（SSH）
  • 附录4 二次PCR产物的纯化回收
  • 附录5 消减文库的构建
  • 附录6 质粒 DNA提取
  • 附录7 反向NORTHERN鉴定
  • 攻读学位期间发表论著

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