海洋季也蒙毕赤酵母菊粉酶的发酵生产、纯化、特性、基因克隆与表达的研究

论文摘要

菊粉作为植物的一种贮存性多糖,主要存在于如菊芋（或称洋姜,Helianthus tuberosus）、菊苣（Cichorium endivia）、大丽花（Dahlia pinnata）、牛蒡（Arctium lappa）等尚未开发利用的植物根茎中。菊粉酶是一种主要来源于微生物的多糖水解酶,它可以在一定的温度条件下水解菊粉为果糖和低聚果糖等,其水解产物在食品发酵、医药卫生等方面都有广泛的应用。菊粉酶的来源广泛,包括霉菌、酵母菌、细菌和放线菌等,但是对于海洋酵母菌产菊粉酶的情况了解甚少,本实验室获得了一株高产菊粉酶的海洋酵母菌strain 1,通过生物学鉴定方法确定该株海洋酵母菌属于季也蒙毕赤酵母（Pichia. guilliermondii）。本实验首先对季也蒙毕赤酵母（P. guilliermondii）strain 1产菊粉酶的液体发酵培养基和发酵条件进行了优化,发现其产酶的最优培养基为4%菊粉,0.5%酵母粉,初始pH值为8.0,海水配制,培养条件为接种量10%（v/v）（OD600nm=20.0）,最适温度28 oC ,170 rpm培养,得到的最高菊粉酶活力达到了61.5U/mL。同时,对strain 1菊粉酶粗酶水解底物菊粉水解菊粉的产物进行了薄层层析检验,发现该酶能够充分水解菊粉,得到的终产物以单糖为主,证明了strain 1菊粉酶具有较高的外切菊粉酶活力。在最适产酶条件下培养,将获得的季也蒙毕赤酵母（P. guilliermondii）strain 1胞外菊粉酶粗酶进行超滤浓缩,通过分子筛SephadexTM G-75和阴离子交换层析柱DEAE Fast Flow分离纯化,纯化后蛋白酶SDS- PAGE凝胶电泳显示分子量约为50kDa。对纯化后的菊粉酶进行了一系列酶学性质的研究,发现纯化后的菊粉酶最适反应pH和最适反应温度分别为6.0和60oC,该酶对温度不敏感,并具有热稳定性,对pH较敏感,只在5-7范围内活力稳定。另外,很多金属离子对纯酶活力有一定程度的激活作用;当存在Hg2+、Mg2+、Ag+时,菊粉酶活明显降低。蛋白抑制剂PMSF和碘乙酸能够强烈抑制菊粉酶活力。纯化后的菊粉酶对底物菊粉的动力学常数Km值和Vmax分别是21.1 mg/mL和0.082 mg min-1蛋白,说明其与底物亲和力较高。纯化菊粉酶对底物菊粉也具有很高的外切菊粉酶活力,水解底物层析发现产物只有单糖。克隆得到了季也蒙毕赤酵母（P. guilliermondii）strain 1胞外菊粉酶基因INU的全长（登陆号EU195799）,共1542bp,无内含子,根据DNA序列推导出该了菊粉酶前体肽的氨基酸序列,共514个氨基酸,推导分子量为58042Da。利用生物学软件分析菊粉酶基因INU及其上下游碱基序列,推导出其启动子和终止子位置及结构特点等。分析菊粉酶前体肽氨基酸序列,推测出N端有18个氨基酸残基的信号肽,并含有10个可能的N端糖基化位点,对菊粉酶前体肽氨基酸序列的保守区进行了分析,推测出约在20-300个氨基酸处具有糖苷酶家族N端特性。同时构建pPICZαAINU表达载体,将克隆得到的strain 1菊粉酶基因INU在巴斯德毕赤酵母真核表达体系中进行了功能表达。对重组酶进行了进行SDS-PAGE检测和Western blotting分析,得到了大小为60kD的重组酶条带,并通过免疫印迹证实了菊粉酶基因在真核表达系统中的表达。诱导48h的重组菊粉酶粗酶液酶活为30.7±0.12 U/ml,使用薄层层析方法检测重组酶对底物菊粉的水解作用,证明了重组酶对菊粉有一定的水解作用。同时还利用响表面方法（RSM）对海洋季也蒙毕赤酵母strain 1的高产菊粉酶突变株M-30的固体发酵条件进行了优化,得到最终的最优条件为初始湿度60.5%,接种量2.5%,麸皮:稻糠=0.42,30 oC培养,初始pH6.5。在最优条件下,突变株M-30固体发酵酶活达到455.9 U/gds,明显高于原始菌株（291.0 U/gds）,说明通过诱变方法确实使突变株的酶活力明显得到了提高,具有稳定的较高的外切菊粉酶活力。综上所述,本实验对于海洋季也蒙毕赤酵母（P. guilliermondii）strain 1菊粉酶的研究较全面系统,对于开发利用海洋酵母菌菊粉酶具有积极意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 菊粉酶的分类和来源
• 2 菊粉酶的发酵及酶活的测定方法
• 3 菊粉酶对底物的水解作用及其应用
• 4 菊粉酶的分离纯化研究
• 5 菊粉酶的基因克隆及表达研究
• 6 巴斯德毕赤酵母表达系统
• 7 海洋酵母的研究进展
• 8 本论文的研究内容和意义
• 第二章 海洋酵母菌strain 1 液体发酵产菊粉酶的研究
• 1 前言
• 2 产菊粉酶菌株strain 1 的常规及分子生物学鉴定
• 3 液体发酵培养基和培养条件优化
• 4 粗酶对菊粉的水解作用
• 5 本章小结
• 第三章 海洋季也蒙毕赤酵母strain 1液体发酵生产菊粉酶的分离纯化和特性研究
• 1 前言
• 2 材料和方法
• 3 结果与讨论
• 4 本章小结
• 第四章 海洋季也蒙毕赤酵母 strain1 菊粉酶基因的克隆及在真核系统中的表达
• 1 前言
• 2 季也蒙毕赤酵母 strain1 菊粉酶基因 INU 全长的克隆
• 2.1 材料和方法
• 2.2 结果与讨论
• 3 菊粉酶基因INU 在真核系统巴斯德毕赤酵母中的表达
• 3.1 材料和方法
• 3.2 结果与讨论
• 4 本章小结
• 第五章 表面响应法研究海洋季也蒙毕赤酵母strain 1 突变株 M-30的固体发酵
• 1 前言
• 2 材料方法
• 2.1 菌株和培养基
• 2.2 试验方法
• 3 结果和讨论
• 3.1 培养基的优化设计
• 3.2 试验数据的分析和验证
• 3.3 固体发酵产粗酶对菊粉底物的水解作用
• 4 本章小结
• 参考文献
• 总结与创新点
• 附录
• 发表文章
• 致谢