小鼠围着床期子宫中多胺相关基因的表达、调节与功能

论文摘要

多胺广泛存在于真核生物细胞内,包括腐胺、亚精胺和精胺,在细胞增殖等过程中发挥重要作用。鸟氨酸脱羧酶（ornithine decarboxylase,Odc）是多胺合成的限速酶,其蛋白降解由Odc抗酶（Odc antizyme,Oaz）介导。Odc与腺苷甲硫氨酸脱羧酶（S-adenosylmethioninedecarboxylase,Amd）、亚精胺合成酶（spermidine synthase,Srm）和精胺合成酶（sperminesynthase,Sms）等可通过一系列生化反应催化多胺的合成。多胺的代谢主要由亚精胺/精胺N1乙酰转移酶（spermidine/spermine N1-acetyltransferase,Sat）、过氧化物酶体N1乙酰基精胺/亚精胺氧化酶（peroxisomal N1-acetyl-spermine/spermidine oxidase,Paox）和精胺氧化酶（spermine oxidase,Smox）等完成。本实验利用原位杂交、实时定量RT-PCR和Western blot等方法,检测了多胺相关基因在围着床期小鼠子宫中的表达,并利用假孕、延迟着床及激素处理等模型研究了这些基因在子宫中的表达与调节。在体外培养水平,我们还检测了Odc及多胺水平对子宫内膜细胞增殖活性以及其它多胺相关基因表达的影响。利用Odc特异性抑制剂α二氟甲基鸟氨酸（α-difluoromethylomithine,DFMO）,我们研究了Odc在胚胎着床过程中的作用。Odc的mRNA和蛋白水平在妊娠第5天子宫的着床位点都显著上调。在妊娠第1-5天子宫中,Oaz1基因的表达方式与Odc极其接近。Srm、Amd1、Sat和Smox等多胺相关基因也在着床位点明显增强。而在早期妊娠小鼠子宫中,基本检测不到Sms和Paox的表达信号。在假孕第5天以及延迟着床子宫中检测不到Odc、Oaz1、Srm、Amd1、Sat和Smox等基因的表达,而在延迟激活子宫的着床位点,这些基因的表达特异性增强。在卵巢切除后用雌激素和/或孕酮处理的小鼠子宫中,Odc mRNA表达信号显著增强,而雌激素或者孕酮受体拮抗剂处理后却检测不到表达信号。在雌激素处理子宫中,可以检测到较强的Oaz1 mRNA表达,但在注油对照或者雌激素及雌激素受体拮抗剂共同处理的子宫中却检测不到表达信号。另外,在类固醇激素处理的小鼠子宫中,检测不到其它多胺相关基因的表达。在体外培养的子宫内膜细胞中,过表达Odc能够促进Oaz1 mRNA的水平。另外,精胺或亚精胺处理后,Sat的表达水平也明显上调。DFMO处理后,子宫内膜基质细胞的增殖活性明显减弱,同时细胞周期调节因子p21的基因表达水平增强。在妊娠第3-4天,通过皮下注射DFMO后,小鼠的着床率明显降低。DFMO处理还能够抑制延迟着床的激活。而用Srm抑制剂——反式4-甲基环己胺（trans-4-methylcyclohexylamine）处理,却对着床没有影响。在DFMO处理后的子宫着床位点中,Amd1 mRNA表达水平明显增强。在体外培养的子宫内膜细胞中,DFMO处理也能够促进Amd1的表达水平,而Odc过表达或者腐胺处理却能够降低Amd1的表达水平。总之,Odc等多胺相关基因在围着床期子宫中的表达与胚胎着床过程密切相关,并且受胚胎活性的调节。Odc和Oaz1在子宫中的表达还受类固醇激素的调节。在子宫内膜细胞中,Odc及多胺水平能够影响Oaz1、Sat和Amd1的表达以及基质细胞的增殖活性。DFMO处理可明显抑制着床,同时引起Amd1表达的上调。这些结果说明Odc等基因在子宫中的表达对于胚胎着床十分重要,为我们深入了解胚胎着床的分子机制提供了新的信息。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 胚胎着床及其分子调控
• 1.1.1 胚胎着床
• 1.1.2 胚胎着床的分子调控
• 1.2 多胺及其相关基因
• 1.2.1 多胺及其代谢网络
• 1.2.2 鸟氨酸脱羧酶（Odc）
• 1.2.3 鸟氨酸脱羧酶抗酶
• 1.2.4 腺苷甲硫氨酸脱羧酶等多胺合成酶
• 1.2.5 亚精胺/精胺N1乙酰转移酶等多胺代谢酶
• 1.3 多胺与哺乳动物发育及生殖
• 1.3.1 多胺与胚胎发育
• 1.3.2 多胺与生殖激素
• 1.3.3 多胺在子宫中的生物活性
• 1.3.4 多胺与雄性生殖
• 1.4 实验目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验动物
• 2.2 动物模型及取材
• 2.2.1 早期妊娠
• 2.2.2 假孕
• 2.2.3 延迟着床和激活
• 2.2.4 激素处理
• 2.2.5 DFMO和4MCHA处理
• 2.3 小鼠子宫内膜上皮和基质细胞的分离、培养及处理
• 2.3.1 培养前准备工作
• 2.3.2 发情期小鼠的鉴定
• 2.3.3 小鼠子宫内膜上皮细胞的分离与培养
• 2.3.4 小鼠子宫内膜基质细胞的分离与培养
• 2.3.5 体外培养小鼠子宫内膜细胞的处理
• 2.4 多胺相关基因的克隆及序列分析
• 2.4.1 菌种和主要分子生物学试剂
• 2.4.2 PCR引物设计
• 2.4.3 组织中总RNA的提取
• 2.4.4 DNA的消化
• 2.4.5 反转录反应
• 2.4.6 PCR反应
• 2.4.7 扩增产物的回收及载体连接
• 2.4.8 感受态细胞的制备
• 2.4.9 转化重组质粒
• 2.4.10 插入方向鉴定
• 2.4.11 核苷酸序列的测定
• 2.4.12 cRNA片段的地高辛标记
• 2.5 原位杂交
• 2.5.1 载玻片的处理
• 2.5.2 冰冻切片方法
• 2.5.3 原位杂交试剂及溶液
• 2.5.4 原位杂交流程
• 2.6 Odc过表达载体的构建
• 2.7 子宫内膜细胞的瞬时转染
• 2.8 实时定量RT-PCR
• 2.8.1 实时定量PCR引物的设计
• 2.8.2 总RNA的提取
• 2.8.3 DNA的消化
• 2.8.4 反转录反应
• 2.8.5 实时定量PCR反应
• 2.8.6 融解曲线的分析
• ΔΔCt法分析基因表达的相对差异'>2.8.7^ΔΔCt法分析基因表达的相对差异
• 2.9 Western blot
• 2.9.1 Western blot试剂及溶液
• 2.9.2 样品提取及蛋白浓度的测定
• 2.9.3 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.9.4 Immunoblot及显影
• 2.10 子宫内膜基质细胞存活数目以及增殖活性的测定
• 2.10.1 细胞存活率的测定
• 2.10.2 MTT法测定细胞增殖活力
• 2.11 数据统计
• 3 结果
• 3.1 多胺相关基因的克隆和鉴定
• 3.2 多胺相关基因在围着床期小鼠子宫中的表达
• 3.2.1 原位杂交检测多胺相关基因在围着床期小鼠子宫中的表达
• 3.2.2 实时定量PCR验证多胺相关基因在妊娠第5天子宫中的表达
• 3.2.3 Western blot检测妊娠第5天子宫中Odc蛋白水平及变化
• 3.3 活性胚泡对围着床期子宫中多胺相关基因表达的影响
• 3.3.1 原位杂交检测多胺相关基因在假孕子宫中的表达
• 3.3.2 原位杂交检测多胺相关基因在延迟着床和激活子宫中的表达
• 3.4 类固醇激素对多胺相关基因在子宫中表达的影响
• 3.5 Odc及多胺水平对子宫内膜细胞中Oaz1表达的调节
• 3.5.1 Odc过表达载体的构建以及对子宫内膜细胞转染效果的鉴定
• 3.5.2 Odc及多胺水平对子宫内膜细胞中Oaz1表达的影响
• 3.6 多胺水平对子宫内膜细胞中Sat等基因表达的调节
• 3.7 DFMO处理对小鼠胚胎着床的影响
• 3.7.1 DFMO处理对正常妊娠小鼠胚胎着床的影响
• 3.7.2 DFMO处理对小鼠延迟激活着床的影响
• 3.8 Odc及多胺水平对子宫中Amd1等基因表达的影响
• 3.8.1 DFMO注射对着床位点中Amd1等基因表达的影响
• 3.8.2 Odc及多胺水平对子宫细胞中Amd1等基因表达的影响
• 3.9 Odc及多胺水平对子宫内膜细胞增殖活性和p21表达的影响
• 3.9.1 DFMO处理对子宫内膜基质细胞增殖活性的影响
• 3.9.2 Odc及多胺水平对子宫内膜细胞中p21表达的影响
• 4 讨论
• 4.1 Odc在围着床期子宫中的表达
• 4.2 围着床期子宫中Odc等基因的调节
• 4.3 子宫中多胺相关基因表达的相互协同
• 4.3.1 Odc和Oaz1在子宫中的协同表达
• 4.3.2 Sat等多胺代谢酶在子宫中的协同表达
• 4.4 DFMO处理对于胚胎着床的影响
• 4.5 Amd1对Odc的补偿效应
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 图版
• 攻读博士学位期间发表的论文