海豚链球菌（Strepstococcus iniae）胞外产物的特性及其对牙鲆的免疫效应

论文摘要

作为重要的水产动物致病菌,链球菌可感染多种野生及养殖鱼类并导致大规模死亡,但对于其毒力相关与免疫相关的关键性蛋白仍知之甚少。本文即选取9株鱼源链球菌,其中包括5株海豚链球菌（Strepstococcus iniae）NUF849、NUF812、NUF701、NUF693和NUF633以及4株停乳链球菌（Strepstococcus dysgalactiae）SD、L2、WZ和HT,将胞外产物作为研究对象,通过对菌株代谢能力、不同菌株胞外产物的蛋白组成及抗原性、同一菌株不同培养条件下胞外产物的蛋白组成及抗原性进行比较,分析了胞外产物的特性,并对牙鲆进行免疫与攻毒（Paralichthys olivaceus）验证了胞外产物的免疫效应。具体方法结果如下:（1）对9株链球菌的生理生化特性进行了分析、比较,利用Rapid STREP 32 E鉴定试剂条探究了菌株对有机物的代谢能力,利用哥伦比亚绵羊血平板验证了菌株的溶血特性。结果显示,9株菌的生理生化特性各异,分泌的代谢酶组成不同;分布有3种溶血类型,即α、β和γ。测算了各菌株对牙鲆的半数致死量、确定了菌株的致病性,其中NUF849毒力最强。这些结果从代谢角度体现了9株菌胞外产物组成上的差异,同时说明所选菌株能够代表不同种属、不同毒力、不同溶血类型及不同代谢能力的链球菌。（2）以强毒株海豚链球菌NUF849为例,从培养时间与浓缩方法两方面优化了链球菌胞外产物的制备方法,即利用平板玻璃纸法培养细菌60 h获得胞外产物后,直接透析除盐并予以冻干。此法制得的胞外产物多样性保持良好。（3）提取了9株链球菌的胞外产物,用SDS-PAGE比较分析其蛋白条带组成、Western-blot比较分析其抗原性。结果表明不同种属、不同来源、不同毒力的菌株所产生的胞外产物不同,表现为条带分子量与丰度的差异。同一物种的细菌胞外产物图谱相近;同一物种、毒力相当但来源不同的菌株如SD和L2图谱也不同;毒力较强的菌株条带较丰富,如毒力较强的NUF849、NUF812与NUF693均有一条分子量约为37 kDa的条带,而毒力较弱的NUF701和NUF633图谱中此条带不明显。菌株间共有条带主要有14、20、25、27、30、38、45、47、50和60 kDa等。胞外产物具有良好抗原性,可为感染NUF849后存活的牙鲆血清所识别,除停乳链球菌WZ反应较弱以外,其他菌株间均存在强烈的交叉反应。菌株间具有多条共有抗原条带,除WZ外的8株菌所共有的条带为27、45、60 kDa等。弱毒株NUF693与NUF633有一分子量约为60 kDa的条带,能够与阴性血清发生强烈反应,而其他菌株、其他条带与阴性血清反应较弱或无反应。（4）选取毒力最强、胞外产物条带丰富的海豚链球菌NUF849,将其置于不同温度、盐度、葡萄糖含量、铁元素含量、气体等环境条件下进行培养,测定24 h生长曲线同时制备其胞外产物进行条带组成与抗原性的比较,以进一步分析胞外产物的特性。结果证实NUF849胞外产物的分泌受环境调控影响,蛋白组成图谱发生变化,且变动的条带具有抗原性。对环境变化敏感且具有抗原性的蛋白条带主要有25、27、37、42、45和60 kDa。这些条带可以作为亚单位疫苗的备选成分。不同的环境条件下,细菌的生长状态也发生变化。最适宜NUF849生长繁殖的环境条件组合为:28℃,在盐度（NaCl含量）和葡萄糖含量均为5‰的培养基中静置培养,可酌量添加动物血清以促进生长。（5）最后分别以海豚链球菌NUF849的福尔马林灭活全菌（FKC）、胞外产物（ECPs）及二者的混合物（FKC+ECPs）免疫牙鲆,分别于免疫前,免疫后和免疫再攻毒后进行取样,验证胞外产物的免疫效应。结果证实胞外产物本身具有交叉保护效果,而且可以辅助灭活全菌刺激牙鲆产生更高水平的免疫应答:FKC+ECPs可诱发更高的血清抗体水平,包括分别抗FKC和ECPs的两种抗体;可显著提高血细胞吞噬能力（P<0.05）;FKC+ECPs组血清中SOD、POD及ACP的活力也体现出较高的免疫应答水平;攻毒实验中,FKC、ECPs和FKC+ECPs三组对同源菌株NUF849的相对免疫保护率分别为50%、40%和90%,对异源菌株NUF812的相对免疫保护率分别为60%、30%和80%,FKC+ECPs组显著高于其他组（P<0.05）。另外,免疫再攻毒后的数据能更为直观的体现出FKC+ECPs组的优势。利用攻毒后存活的牙鲆血清分析NUF849及NUF812的抗原性,结果发现两株菌的超声破碎全菌和胞外产物中均包含良好抗原,胞外产物中抗原更为丰富。破碎全菌中发生反应的条带分布于25-100 kDa,胞外产物中发生反应的条带分子量则分布于18-100 kDa。胞外产物中,NUF849和NUF812主要的共有抗原条带为37、45和60 kDa。综合上述结果,可以确定海豚链球菌NUF849的胞外产物中存在保护性抗原以及在致病过程中起重要作用的蛋白。这些蛋白的分子量有可能为25、27、37、42、45和60 kDa。本文可为从链球菌胞外产物中筛选关键性蛋白、研制具有交叉保护效果的高效疫苗提供参考。

论文目录

• 摘要
• Abstracts
• 1. 前言
• 1.1 鱼类链球菌疾病概述
• 1.2 胞外产物分泌蛋白质组学研究
• 1.3 鱼用链球菌疫苗的研究进展
• 1.4 本文研究目的与创新点
• 2. 海豚链球菌NUF849 等9 株链球菌的基本特性
• 2.1 生理生化特性分析
• 2.2 9株链球菌对牙鲆的致病特性分析
• 3. 菌株间胞外产物的蛋白条带组成与抗原性分析
• 3.1 胞外产物制备条件的优化
• 3.2 9株链球菌胞外产物蛋白条带组成与抗原性分析
• 4. 不同培养条件下海豚链球菌强毒株 NUF849 的生长状态、胞外产物蛋白条带组成与抗原性分析
• 4.1 不同培养条件下NUF849 的生长曲线
• 4.2 培养条件对NUF849 胞外产物蛋白组成的影响
• 4.3 不同培养条件下NUF849 胞外产物的抗原性分析
• 5. NUF849 胞外产物对牙鲆的免疫效应
• 5.1 3种免疫原引发的牙鲆血清抗体水平的变化
• 5.2 3种免疫原对牙鲆血细胞吞噬能力及SOD、POD 和ACP 活力的影响
• 5.3 3种NUF849 免疫原的保护效果
• 小结
• 参考文献
• 附录: 试剂配方
• 致谢
• 发表的学术论文