原果胶酶在毕赤酵母中的表达、发酵优化及酶学性质研究

论文题目: 原果胶酶在毕赤酵母中的表达、发酵优化及酶学性质研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 食品科学

作者: 刘战民

导师: 陆兆新

关键词: 枯草杆菌,原果胶酶,毕赤酵母,高密度发酵,表达纯化,酶学性质

文献来源: 南京农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 原果胶酶是能水解不溶性果胶物质为可溶性果胶物质的一类酶。1978年Sakai等首次报道了酵母生产的原果胶酶，之后相继报道了细菌、酵母和霉菌中的原果胶酶的酶学性质及原果胶酶的应用。在中国，有关微生物原果胶酶的研究和应用技术还未见报道，原果胶酶基因在Pichia pastoris中表达的研究在国内外未见报道。本论文主要报道了产原果胶酶B.subtilis XZ2的筛选、原果胶酶基因在Pichia pastoris中克隆表达、重组原果胶酶的纯化和酶学性质等研究内容，研究的主要结果如下：1．通过对本研究室保藏的菌种进行筛选，获得了一株产原果胶酶的B.subtilis XZ2。以B.subtilis XZ2的基因组DNA为模板，PCR扩增得到原果胶酶基因。测序结果表明：B.subtilis原果胶酶基因全长1200bp，编码399个氨基酸，与GenBank中收录的B.subtilis的原果胶酶基因（GenBank Accession：X74880）相比较，有4个碱基发生了替换，其同源性为99.6％，编码的氨基酸序列同源性为99.5％，二者原果胶酶蛋白基因相应的氨基酸序列、氨基酸残基个数、位置几乎完全相同，仅有2个氨基酸不同。同时，替换的氨基酸不位于原果胶酶的两个保守区域。2．扩增的原果胶酶基因与毕赤酵母载体pPICZαA经限制性内切酶XhoⅠ和XbαⅠ双酶切，回收片段经T4 DNA ligase、16℃过夜连接，连接产物经CaCl2转化E.coli DH5α，获得重组酵母表达载体pPICZαA-PPase。经限制性内切酶BstⅪ线性化的pPICZαA-PPase载体与酵母感受态细胞X-33在1500V，25μF，200Ω条件下电转化，经过100、200、400、800μg和1000μg/ml zeocin筛选和酵母基因组PCR鉴定，最终获得重组表达菌株X-33/pPICZαA-PPase。3．对影响X-33/pPICZαA-PPase表达原果胶酶的培养基、诱导时间、甲醇浓度、诱导前菌体生长量、诱导培养基pH以及PTM1添加量等因素进行了研究，结果显示在使用BMGY/mBMMY培养基、诱导环境pH6.0、0.006％PTM1、诱导前最佳菌体0D600为6-8、1％甲醇诱导、转速240r/min，30℃诱导培养96h，可以获得较好的表达水平；高密度发酵阶段，控制溶氧20％，氨水流加控制培养基pH 6.0，经过210h发酵培养菌体光密度超过了250，湿菌体达到了192g/L，蛋白含量为3.21g/L，原果胶酶活性达到最高240.2 U/ml。5．摇瓶发酵获得的原果胶酶粗酶液经过硫酸铵沉淀、Sephadex G75凝胶过滤和Sepharose Fast Flow离子交换层析分离，比活力分别提高为219.27 U/mg、752.48 U/mg、1948.64 U／mg，纯化倍数分别为2.13、7.31和18.91，最终获得的原果胶酶经SDS-PAGE电泳测定分子量为43.17 kDa。6．原果胶酶最适作用温度和pH分别50℃和7.0。在pH 3-10范围内，原果胶酶活性很稳定，热稳定性为50℃以下。金属离子对于原果胶酶活性抑制强弱顺序为Hg2+＞Cu2+＞Ba2+＞Mn2+，而Fe2+和Mg2+对该酶没有抑制作用。Ca2+能够提高原果胶酶活性，当浓度为0.20 mM时，原果胶酶活性提高到原来的2.5倍左右，EDTA完全抑制原果胶酶活性。原果胶酶的Km为0.851 mg／ml，Vmax为0.445μmol／min。

论文目录:

摘要

ABSTRACT

缩写符号

表格索引

图形索引

第1章 微生物原果胶酶的研究

1.1 文献综述

1.2 毕赤酵母表达系统

1.3 本研究的目的及意义

参考文献

第2章 产原果胶酶枯草杆菌的筛选以及原果胶酶基因的克隆与序列分析

2.1 材料与方法

2.2 结果

2.3 讨论

本章小结

参考文献

第3章 原果胶酶在毕赤酵母中的表达

3.1 材料与方法

3.2 实验结果

3.3 讨论

本章小结

参考文献

第4章 毕赤酵母产原果胶酶摇瓶发酵条件优化及高密度培养研究

4.1 材料与方法

4.2 结果

4.3 讨论

本章小结

参考文献

第5章 毕赤酵母工程菌原果胶酶的纯化及酶学性质研究

5.1 材料与方法

5.2 结果

5.3 讨论

本章小结

参考文献

论文创新之处

致谢

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发布时间: 2006-10-20

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