基于体积放大技术的单个DNA分子检测

论文摘要

本论文共分三章，第一章：单分子检测及磁球技术概述，第二章：基于磁球／微球的检测单个pUC19质粒DNA，第三章：致炭疽热的单个DNA分子的定量分析。第一章对单分子检测及磁球技术进行了综述。首先介绍了单分子检测的研究概况，主要包括单分子检测的主要内容、特点和采用的技术，重点介绍了单分子检测所采用的技术，涉及到光学方法、扫描探针显微方法和化学方法。其次介绍了磁球的研究现状和应用，重点介绍了磁球在DNA的分离与检测、酶的固定化、细胞分选、免疫检测等的应用。本章共引用文献85篇。第二章中我们用一种新的、简单的方法检测单个pUC19质粒DNA分子。首先我们取一定量的磁球（直径0.35μm）与过量捕捉探针反应，利用磁分离除去过量的捕捉探针，然后将少量目标DNA分子与远远过量的上述连接有捕捉探针的磁球在杂交缓冲溶液中充分反应，这样一个目标DNA分子通过杂交反应会结合到一个磁球上。第二步取一定量的微球（直径9.95μm）与检测探针反应，通过离心分离、清洗除去过量的检测探针。第三步将上述两步反应的产物按一定比例混合，进行杂交反应，最终通过目标DNA分子与磁球—微球的联结，形成磁球—目标DNA—微球的夹心复合体。因为在以上比例下结合了检测探针微球的浓度大大地大于结合了目标DNA磁球的浓度，所以只有一个结合了单个目标DNA分子的磁球可以结合到微球上。用磁分离除去未反应的微球，将此溶液清洗后滴加在载玻片上，用倒置显微镜以十或二十倍物镜用或者一百或二百倍物镜观察。在显微镜下看到的微球，就是一个磁球—目标DNA—微球的夹心复合体。其观测到的微球数目也就是单个目标DNA分子的数目。这个方法的最大优点是不需用复杂而昂贵的仪器，只用普通的显微镜配合常用的CCD（也可用目视）就可实现单个DNA分子的检测。第三章我们同样采用了磁／微球技术的体积放大效应，通过增加反应时间和用自制振荡器改变震荡条件提高了杂交反应产率，以炭疽热的单个DNA分子为目标，研究了单分子个数与浓度的定量关系。为了准确、方便地进行单分子计数，我们制作了底部刻蚀有坐标方格的小池子，然后在倒置显微镜下按照坐标方格移动载物台，用CCD对每个小池子进行拍照。因为有坐标方格作为参照标准，所以拍出的照片就不会出现重复和遗漏。然后再根据拍出的照片，对微球个数进行单分子计数。对炭疽热的单个DNA分子，浓度范围在1.0×10-19mol／L-8.0×10-19mol／L间，单分子个数与浓度有正比关系。

论文目录

• 符号与缩写
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 单分子检测磁球技术概述
• 1.1 单分子检测
• 1.1.1 单分子检测的内容及特点
• 1.1.2 单分子检测的技术
• 1.1.2.1 光学方法
• 1.1.2.1.1 扫描近场光学显微镜
• 1.1.2.1.2 共聚焦荧光显微术
• 1.1.2.1.3 全内反射荧光显微术
• 1.1.2.1.4 表面增强拉曼光谱
• 1.1.2.2 扫描探针显微镜
• 1.1.2.3 化学方法
• 1.1.2.3.1 电化学检测
• 1.1.2.3.2 化学发光
• 1.1.2.3.3 毛细管电泳
• 1.2 磁球技术
• 1.2.1 磁球概述
• 1.2.2 磁球的应用
• 1.2.2.1 DNA的分离与检测
• 1.2.2.2 酶的固定化
• 1.2.2.3 细胞分选
• 1.2.2.4 免疫检测
• 1.3 展望
• 1.4 参考文献
• 第二章 基于磁球/微球检测单个pUC19质粒DNA
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 实验仪器
• 2.2.2 材料与试剂
• 2.2.3 实验方法
• 2.2.3.1 实验策略
• 2.2.3.2 目标DNA、捕捉探针和检测探针的选择与确定
• 2.2.3.3 高压灭菌
• 2.2.3.4 磁球及微球的预处理
• 2.2.3.5 DNA单分子检测的反应
• 2.2.3.6 单个DNA分子的检测
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 理论分析
• 2.3.2 单分子DNA检测
• 2.4 结论
• 2.5 参考文献
• 第三章 致炭疽热的单个DNA分子的定量分析
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 实验仪器
• 3.2.2 材料与试剂
• 3.2.3 实验方法
• 3.2.3.1 高压灭菌
• 3.2.3.2 简易振荡器的制作
• 3.2.3.3 微球计数器的制作
• 3.2.3.4 磁球及微球的预处理
• 3.2.3.5 DNA单分子检测的反应
• 3.2.3.6 单个DNA分子的检测
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 微球计数器的规格选择
• 3.3.2 DNA杂交反应条件的选择
• 3.3.3 微球静止时间的选择
• 3.3.4 单分子计数
• 3.3.5 单分子个数与浓度的关系
• 3.3.6 误差讨论
• 3.4 结论
• 3.5 参考文献
• 附录
• 致谢
• 学位论文评阅及答辩情况表