中国马传染性贫血病毒驴强毒株与驴白细胞弱毒疫苗株前病毒全基因组序列分析

论文摘要

马传染性贫血病毒是反转录病毒科慢病毒属的重要成员,是马传染性贫血的病原体。在上世纪七十年代我国成功研制的马传染性贫血白细胞弱毒疫苗,为我国成功控制了马传染性贫血的流行。马传然性贫血白细胞弱毒疫苗的致弱机理将为其他慢病毒疫苗的开发提供借鉴。本文为阐明马传染性贫血弱毒疫苗的致弱机制和免疫保护机理,结合准株理论,利用LA-PCR技术对马传染性贫血病毒驴强毒株（DV）和驴白细胞弱毒疫苗株（DLV）的前病毒DNA分两段进行扩增,挑取多个克隆测序。最后获得10个DLV前病毒序列,4个DV前病毒DNA序列,21个DLV的LTR,19个DV的LTR,并构建了DV的全长克隆。通过分析比较得出,DV前病毒基因组与DLV前病毒基因组的平均差异率是2.8%。其中S2、LTR和env基因差异较大,核苷酸序列差异率分别是4.1%、3.9%和3.1%;S2、S3和env推导的氨基酸的差异率较大,分别是10.4%、5.6%和4.8%。与国外毒株相比,中国马传染性贫血病毒属于独特的一个支系。本实验首次发现体外培养的DLV株的至少有5种类型的LTR混合存在。gp90推导的氨基酸序列上中国EIAV强毒株比弱毒株多2个N-糖基化位点,其中强毒株有3个特有的N-糖基化位点;弱毒株有1个。总之,本文结合准株理论对中国马传贫驴强毒株和白细胞弱毒疫苗株前病毒基因组核苷酸进行分析,对中国马传贫病毒强弱毒株间的一致性变化进行了讨论,并成功构建了DV株的全长基因组克隆,为进一步研究EIAV毒力的变化和免疫保护的分子机制奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 马传染性贫血病毒概述
• 1.1.1 EIAV 形态结构和理化特性
• 1.1.2 EIAV 的细胞嗜性
• 1.1.3 EIAV 的致病性
• 1.1.4 国内外 EIAV 毒株及特性
• 1.2 马传染性贫血病毒的分子生物学特性别
• 1.2.1 EIAV 基因组结构
• 1.2.2 EIAV 的基因及其编码蛋白
• 1.2.3 EIAV 的非编码区——LTR
• 1.3 准株理论与 LA-PCR 技术
• 1.3.1 准株理论
• 1.3.2 LA-PCR 技术及其优势
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 病毒和细胞
• 2.1.2 质粒和菌株
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 引物
• 2.1.5 培养基
• 2.1.6 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 驴白细胞的分离与培养
• 2.2.2 前病毒 DNA 的提取
• 2.2.3 EIAV 前病毒 DNA 分段两段扩增和基因克隆
• 2.2.4 EIAV 全基因克隆的构建
• 2.2.5 测序结果分析
• 3 结果
• 3.1 EIAV 前病毒DNA PCR 扩增及不同片段克隆质粒的鉴定
• 3.2 DV117 全基因克隆的构建
• 3.3 低拷贝载体 PLGW 的构建
• 3.4 DV117 和DLV122 前病毒核苷酸全序列和各基因及其编码的氨基酸序列
• 3.4.1 LTR 的比较结果
• 3.4.2 gag 及其编码氨基酸序列的比较
• 3.4.3 pol 基因及其氨基酸序列比较
• 3.4.4 env 基因及其氨基酸序列
• 3.4.5 S1 基因及其编码的蛋白 Tat
• 3.4.6 S2 基因及其编码氨基酸序列
• 3.4.7 S3 及其编码的rev 蛋白
• 4 讨论
• 4.1 强弱毒株 LTR 的变异分析
• 4.1.1 LTR 序列变异性
• 4.1.2 LTR 细胞转录因子结合位点的变化
• 4.2 env 的变异及其生物学意义
• 4.3 其他基因的变异和生物学意义
• 4.4 准株理论与 EIAV 的研究
• 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介