一、The Expression of Toll-like Receptor 2 and 4 mRNA in Local Tissues of Model of Oropharyngeal Candidiasis in Mice（论文文献综述）
范氏绒[1]（2021）在《昆断益母方调控Treg/Th17细胞失衡和抗类风湿关节炎的机制研究》文中研究指明目的:类风湿关节炎是一种以影响关节和软骨的慢性炎症为特征的自身免疫性疾病,可导致不同程度的关节疼痛、僵硬、肿胀和畸形,并可引起不同程度的残疾。目前治疗类风湿关节炎的主要目的是缓解疼痛和炎症,减少关节损伤和残疾,维持或改善身体机能,保证正常的生活质量。中国是中草药大国,中医药治疗类风湿关节炎历史悠久,治疗经验和策略丰富,使中医药在临床治疗类风湿关节炎中广泛应用。在“因地制宜”“辨证论治”理念的指导下,本实验室拟出了昆断益母方这一临床使用有效的复方。实验室前期的研究已经证实昆断益母方对类风湿性关节炎有很好的疗效。作为一名越南医生,已将昆断益母方在越南进行推广,并取得一定的临床成果。但是其治疗类风湿关节的作用机制仍然大量未知。近年来,随着人们对类风湿性关节炎发病机制认识的不断深入,发现辅助性T17细胞（T helper 17,Th17）与调节性T细胞（regulatory T,Treg）之间的功能失衡是引起类风湿性关节炎发病的发病机制之一。因此,本研究利用小鼠类风湿性关节炎的动物模型-胶原诱导性关节炎（collagen-induced arthritis,CIA）和体外细胞实验探讨昆断益母方对CIA小鼠和细胞内Th17/Treg失衡、炎症因子以及micro RNAs表达水平调控的作用,为昆断益母方类治疗类风湿性关节炎的作用机制提供新的理论依据。方法:（1）24只SPF级9周龄雄性DBA/1小鼠,采用随机数字表法将小鼠随机分为4组:正常组（Normal）、模型组（Model）、甲氨蝶呤组（MTX）和昆断益母方组（KDYMF）。以正常小鼠作为正常组,以MTX为阳性对照组,确保每组样本量为6只。采用牛II型胶原（collagen II,CII）免疫小鼠,诱导发生关节炎。自初次免疫后第21天（即第二次加强免疫当天,也就是造模完成当天）开始,给予相应的处理,昆断益母方（KDYMF）（0.2 m L/10g）,每天灌胃1次,连续2周;甲氨蝶呤（MTX）组,给予2 mg/kg,每周灌胃2次,连续2周;正常对照组给予等体积生理盐水,每天灌胃1次,连续2周后。每2天观察四肢临床评分,第35天予小鼠脱颈椎处死。在第35天取小鼠血液、脾脏、关节滑膜及软骨组织。HE染色检测踝关节组织病理学改变。（2）采用RT-qPCR方法检测第35天时外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）和关节滑膜组织中Treg细胞的特异性转录因子-特异性转录因子叉头蛋白p3（forkhead box p3,Foxp3）和Th17细胞的特异性转录因子-维甲酸相关孤儿受体γt（retinoid-related orphan nuclear receptor,RORγt）的m RNA表达水平;血清、关节滑膜组织和关节软骨组织中的Toll样受体4（Toll-like receptors 4,TLR4）和信号传导及转录激活因子3（signal transducers and activators of transcription,STAT3）m RNA表达水平;血清和关节滑膜组织中miR-21-5p表达水平。ELISA方法测定第35天时PBMC中白介素（interleukin,IL）-1β（IL-1β）、IL-17、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、IL-10的表达水平。（3）分离小鼠脾脏初始T细胞,置于IL-6（30 ng/m L）的极化环境进行培养,然后对细胞进行昆断益母方（KDYMF,600μg/m L）干预,实验分为4组,分别为对照组（Control）、昆断益母方组（KDYMF）、IL-6组（IL-6）、IL-6+昆断益母方组（IL-6+KDYMF）。培养48h后,RT-q PCR检测各组细胞中IL-17,IL-1β,TNF-α,IL-10的表达。随后对各组细胞给予anti-CD4抗体（2μg/m L）和anti-CD25抗体（2μg/m L）激活,流式细胞仪检测分析Th17和Treg细胞的比例。（4）小鼠原始T细胞,添加IL-6（30 ng/m L）同小鼠成纤维细胞样滑膜细胞同时极化培养,然后对细胞进行昆断益母方（KDYMF,600μg/m L）干预,实验分为4组,初始T细胞+滑膜细胞组（Control）,初始T细胞+滑膜细胞+昆断益母方组（KDYMF）、初始T细胞+IL-6+滑膜细胞组（IL-6）、初始T细胞+IL-6+滑膜细胞组+昆断益母方组（IL-6+KDYMF）,培养48h后,CCK8方法检测滑膜细胞的增殖;培养48h后,Transwell检测滑膜细胞迁移和侵袭;RT-q PCR检测各组滑膜细胞中miR-21-5p表达水平,以及Foxp3和RORγt的m RNA表达水平。结果:（1）从第25天开始,模型组（Model组）小鼠双侧的踝关节出现明显的类风湿性关节炎临床症状,在第35天时大部分小鼠表现踝关节强直样改变。甲氨蝶呤灌胃治疗（MTX组）和经过昆断益母方灌胃的治疗（KDYMF组）小鼠踝关节并没有出现明显的红肿,并且关节活动度也与正常小鼠无明显差异。（2）CIA小鼠踝关节组织HE染色病理结果显示,模型组小鼠踝关节结构破坏严重,炎症细胞浸润明显,滑膜增生,导致软骨及骨破坏。DTYMD组及MTX组踝关节相对完整,滑膜增厚不明显,少量炎症细胞浸润。（3）CIA小鼠在免疫的第35天时,与Model组相比,MTX组和KDYMF组小鼠的血液PBMC和关节滑膜组织中Foxp3的m RNA相对表达水平均表现上调,但在KDYMF组小鼠中更显着;而MTX组和KDYMF组小鼠的血液PBMC和关节滑膜组织中RORγt的m RNA相对表达水平均表现下调,在KDYMF组小鼠中更显着。（4）CIA小鼠在免疫的第35天时,与Model组相比,MTX组小鼠的血液PBMC中IL-1β、IL-17、TNF-α表达水平均表现上调,但IL-10表达水平表现出显着下调;KDYMF组小鼠的血液PBMC中IL-1β、IL-17、TNF-α表达水平均低于MTX组,更接近Normal组表达水平;而IL-10表达水平高于MTX组,更接近Normal组表达水平。（5）CIA小鼠在免疫的第35天时,与Model组相比,MTX组和KDYMF组小鼠的血清和关节滑膜组织中miR-21-5p相对表达水平均表现上调,但在KDYMF组小鼠中更显着。（6）CIA小鼠在免疫的第35天时,与Model组相比,MTX组和KDYMF组小鼠的血清、关节滑膜组织和关节软骨组织中TLR4和STAT3的m RNA相对表达水平均表现下调,但在KDYMF组小鼠中更显着,更接近Normal组表达水平。（7）昆断益母方能抑制初始T细胞中炎症因子IL-17、IL-1β和TNF-α表达,但促进IL-10表达。IL-6刺激能促进初始T细胞中炎症因子IL-17、IL-1β和TNF-α表达,但抑制IL-10表达;昆断益母方能降低经IL-6刺激能促进初始T细胞中炎症因子IL-17、IL-1β和TNF-α表达,而上调IL-10表达。（8）昆断益母方能上调初始T细胞分化出来的Treg细胞比例,降低Th17细胞比例。IL-6刺激会明显增加Th17细胞数目,降低Treg细胞数目;但是昆断益母方药能增加Treg细胞比例,下调Th17细胞比例,使Treg细胞和Th17细胞更接近正常水平。（9）昆断益母方能明显抑制正常条件下类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞的增殖、迁移和侵袭,同时也能明显抑制T细胞经IL-6刺激后与类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞共培养后细胞的增殖、迁移和侵袭。（10）昆断益母方能明显促进正常条件下类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中miR-21-5p和Foxp3的m RNA的相对表达,降低RORγt的m RNA相对表达水平。同时也能明显上调T细胞经IL-6刺激后与类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞共培养后细胞中miR-21-5p和Foxp3的m RNA的相对表达,降低RORγt的m RNA相对表达水平。结论:（1）CIA模型小鼠体内存在Th17/Treg细胞功能失衡。（2）从CIA小鼠模型和体外细胞模型证实了昆断益母方能够显着提高血清或细胞中IL-10水平,下调IL-1β、IL-17和TNF-α炎症因子水平。（3）从CIA小鼠模型和体外细胞模型证实了昆断益母方能够显着抑制Th17细胞分化,促进Treg细胞生成,改善Treg/Th17失衡状态。（4）昆断益母方能够抑制类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞的增殖、迁移和侵袭。（5）昆断益母方能够促进细胞内miR-21-5p的相对表达水平。
韩芳[2]（2021）在《TSLP及cGAS-STING调控角膜抗真菌感染免疫反应的作用及机制研究》文中认为真菌性角膜炎（FK）是由致病性真菌引起的最具破坏性的角膜感染性疾病之一,其发病率高且遍布全球。长期佩戴隐形眼镜和外伤分别是发达国家和发展中国家真菌性角膜炎最重要的发病诱因。真菌性角膜炎通常在感染诸如烟曲霉菌（Aspergillus fumigatus）和镰刀菌（Fusarium）等病原性真菌的人群中发展。其中,中国最常见的病原性真菌是与植物相关的烟曲霉菌。由于滥用抗生素、过量使用皮质类固醇、视力预后不良以及缺乏有效的对症治疗方法,真菌性角膜炎已经成为许多发展中国家致盲的主要病因。因此,阐明真菌性角膜炎的发病机理并且开发新的治疗方法具有重要意义。天然免疫和适应性免疫均参与角膜抗真菌感染的过程。天然免疫是机体控制感染的第一道宿主防线。在角膜发生感染以后,角膜上的模式识别受体（PRRs）与真菌病原体相关的分子模式（PAMP）相互作用,进而启动天然免疫应答以保护角膜免受真菌病原体的侵害。此反应过程产生大量的趋化因子和细胞因子来募集炎性细胞并消除病原体,这对于维持正常的角膜结构至关重要。被激活的天然免疫随后启动有效的获得性免疫反应。树突状细胞（DCs）是专业的抗原呈递细胞（antigen presenting cells,APC）,在启动抗真菌天然免疫反应过程中起重要作用。DCs通过识别环境中的抗原性物质,表达识别烟曲霉菌的多种PRRs,进而通过抗原呈递和分泌细胞因子诱导T细胞免疫反应。CD4+T细胞在适应性免疫中具有至关重要的作用。当受到抗原刺激后,幼稚CD4+T细胞被激活、增殖并分化为具有不同效应表型的细胞,包括Th1（helper T cell 1）、Th2、Th17 和调节性 T（T regulatory,Treg）细胞等。许多研究表明,DCs分泌的细胞因子,比如IL-1β、IL-6和IL-23,能够促进细菌和真菌感染过程中Th17炎症反应的发展。然而,在真菌性角膜炎中,烟曲霉菌是否诱导Th17型炎症反应尚不明确。DCs如何感知烟曲霉菌并进一步诱导CD4+T细胞分化也需要进一步的探究。胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）是一种IL-7相关的细胞因子,主要在上皮细胞受到细菌、真菌、寄生虫和炎性细胞因子刺激时表达。最近的研究证实其他多种类型的细胞,例如肥大细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、DCs、滋养层细胞、癌症或癌症相关细胞也能够在特定炎症条件下产生TSLP。已有研究表明DCs分泌的TSLP能够诱导Th2型炎症反应并且参与多种过敏性疾病（哮喘、过敏性皮炎、炎症性肠病）的发病过程。我们课题组先前的研究证实,烟曲霉菌刺激人角膜上皮细胞（HCECs）分泌的TSLP可以促进DCs增殖,诱导DCs成熟并分泌TNF-α、IL-4和IL-13等细胞因子,最终诱导Th2型炎症反应。但是,在烟曲霉菌刺激下DCs是否分泌TSLP,以及TSLP在烟曲霉菌诱导的Th17炎症反应中的作用尚不清楚。环状GMP-AMP（cGAMP）合酶（cGAS）是一种胞质DNA传感器,通过产生第二信使cGAMP活化干扰素基因刺激蛋白（stimulator of interferon gene,STING）介导的信号级联反应,进一步促进Ⅰ型干扰素（IFNs）的产生并激活天然免疫反应。cGAS-STING信号通路不仅可以介导针对病原体感染的保护性免疫反应,还可以识别肿瘤来源的DNA并产生内在抗肿瘤免疫。但是,自身和病原体DNA对cGAS-STING信号通路的异常激活也会导致自身免疫和炎症性疾病。因此,保持对cGAS-STING信号通路的适当激活至关重要。HCECs分布在人角膜组织的最外层,是角膜抵抗病原体感染的第一道屏障。角膜受到病原体感染以后,激活HCECs中的PRRs并启动天然免疫反应。然而,烟曲霉菌是否可以激活HCECs中cGAS-STING信号通路以及该通路在真菌性角膜炎中的作用尚不明确。在本论文中,我们致力于揭示烟曲霉菌感染的DCs分泌的TSLP在Th17炎症反应中的作用,进一步阐明体外和体内促成Th17细胞对真菌性角膜炎免疫应答的分子机制。此外,我们还将探究cGAS-STING信号通路在真菌性角膜炎中作用及机制。本论文研究内容主要分为以下三个部分:第一部分烟曲霉菌刺激DCs分泌TSLP诱导Th17型炎症反应研究1.研究目的本部分旨在研究烟曲霉菌刺激的DCs是否诱导CD4+T细胞向Th17细胞分化,明确DCs在诱导Th17型获得性免疫中的作用。研究烟曲霉菌是否促进DCs分泌TSLP,明确TSLP在烟曲霉菌刺激的DCs诱导的Th17炎症反应中的作用。2.研究方法2.1 从C57BL/6小鼠的股骨和胫骨中分离出骨髓来源的树突状细胞（BMDCs）。使用小鼠CD4+T细胞分选试剂盒纯化小鼠脾脏来源的CD4+T细胞。使用流式细胞术鉴定分离得到的DCs和CD4+T细胞的纯度以及活化水平。2.2 将烟曲霉菌刺激的DCs与CD4+T细胞共培养3到4天,使用CFSE检测CD4+T细胞增殖水平。使用qRT-PCR和流式细胞术检测CD4+T细胞中Th17细胞因子IL-17A、IL-17F和IL-22表达水平。2.3 烟曲霉菌刺激DCs 1、3、6、12、24和48小时后,使用qRT-PCR、ELISA、Western blot和免疫荧光检测DCs中TSLP表达水平。2.4 使用“角膜划线法”构建小鼠真菌性角膜炎模型。使用裂隙灯观察拍照、荧光素染色和H&E染色评估小鼠角膜炎进展。对小鼠角膜炎进行临床评分。使用qRT-PCR和免疫荧光检测TSLP和CD11c在小鼠角膜组织中表达情况。2.5 使用rmTSLP处理幼稚CD4+T细胞3到4天,使用CFSE检测CD4+T细胞增殖水平。使用qRT-PCR、ELISA和流式细胞术检测Th17细胞因子的表达水平。2.6 使用 TSLP siRNA 敲低 DCs 中 TSLP,使用 TSLPR siRNA 敲低 CD4+T 细胞中TSLPR,使用Western blot检测TSLP和TSLPR敲低效率。使用CFSE检测CD4+T细胞增殖水平。使用qRT-PCR和流式细胞术检测Th17细胞因子的表达水平。2.7 小鼠结膜下注射TSLP siRNA或rmTSLP预处理,然后使用烟曲霉菌感染小鼠角膜1天。使用裂隙灯拍照观察和荧光素染色评估小鼠角膜炎进展。对小鼠角膜炎进行临床评分。使用qRT-PCR和ELISA检测TSLP、IL-17A、IL-17F和IL-22在小鼠角膜组织中表达情况。3.研究结果3.1 分离纯化得到纯度合格的DCs和CD4+T细胞。CD3+CD4+的CD4+T细胞比例超过95%。流式细胞术表明烟曲霉菌刺激可以提高DCs中细胞表面CD80、CD86 和 MHC-Ⅱ 表达水平。3.2 CFSE分析表明烟曲霉菌刺激的DCs促进幼稚CD4+T细胞增殖。烟曲霉菌刺激的DCs提高CD4+T细胞中IL-17A、IL-17F和IL-22 mRNA水平。流式细胞术结果表明烟曲霉菌刺激的DCs与CD4+T细胞共培养,促进CD4+T细胞表达 IL-17A。3.3 qRT-PCR、ELISA、Western blot表明烟曲霉菌处理促进DCs表达TSLP。免疫荧光结果也表明烟曲霉菌提高DCs中TSLP表达水平。3.4 感染烟曲霉菌后第1天小鼠角膜炎症状最为严重。在小鼠真菌性角膜炎模型中,TSLP和DCs标记蛋白CD11c在小鼠角膜组织中的表达明显增加。3.5 外源性rmTSLP促进幼稚CD4+ T细胞增殖。qRT-PCR和ELISA结果表明rmTSLP可以提高CD4+T细胞中IL-17A、IL-17F和IL-22表达水平。3.6 在DCs中TSLP敲低效率高达80%以上。在DCs细胞中敲低TSLP以后,烟曲霉菌刺激的DCs不能促进CD4+T细胞增殖,也不能促进CD4+T细胞中IL-17A、IL-17F和IL-22表达。同样,在CD4+T细胞中敲低TSLPR以后,烟曲霉菌刺激的DCs也不能诱导CD4+T细胞向Th17细胞分化。3.7 外源性rmTSLP促进小鼠真菌性角膜炎进展和角膜组织中IL-17A、IL-17F和IL-22表达水平。敲低TSLP明显抑制烟曲霉菌诱导的小鼠真菌性角膜炎进展和小鼠角膜组织中Th17细胞因子表达。4.研究结论4.1烟曲霉菌刺激的DCs促进CD4+T细胞增殖并诱导CD4+T细胞向Th17细胞分化。4.2 烟曲霉菌促进DCs和小鼠真菌性角膜炎模型角膜组织中TSLP表达。4.3 烟曲霉菌刺激的DCs通过TSLP促进CD4+T细胞增殖并诱导Th17炎症反应。4.4 烟曲霉菌在小鼠角膜炎模型中通过TSLP促进Th17炎症反应。第二部分TSLP通过JAK/STAT信号通路诱导Th17炎症反应机制研究1.研究目的本部分旨在研究烟曲霉菌刺激的DCs诱导幼稚CD4+T细胞向Th17细胞分化所涉及的具体信号通路。在细胞水平和小鼠真菌性角膜炎模型中,研究该信号通路在Th17炎症反应和真菌性角膜炎发展过程中的具体作用机制。2.研究方法2.1将烟曲霉菌刺激的DCs与CD4+T细胞共培养4天,提取CD4+T细胞RNA进行高通量测序,鉴定参与CD4+T细胞向Th17细胞分化所涉及的具体信号通路。使用qRT-PCR验证测序得到的JAK/STAT信号通路关键分子的变化。2.2 CD4+T细胞与烟曲霉菌刺激的DCs共培养或使用外源性rmTSLP处理,使用Western blot检测Th17转录因子RORyt及JAK/STAT信号通路蛋白p-JAK1、p-JAK2和p-STAT3表达水平。敲低TSLP或TSLPR后,将烟曲霉菌刺激的DCs与CD4+T细胞共培养4天,使用Western blot检测JAK/STAT信号通路蛋白表达水平。2.3共培养体系中,使用JAK1/JAK2抑制剂ruxolitinib或STAT3抑制剂BBI608处理,然后使用流式细胞术检测CD4+T细胞中IL-17A的表达水平,使用qRT-PCR检测CD4+T细胞中IL-17A、IL-17F和IL-22的mRNA表达水平。在rmTSLP处理CD4+T细胞体系中加入ruxolitinib或BBI608,再次使用流式细胞术和qRT-PCR检测Th17细胞因子表达水平。2.4小鼠结膜下预注射ruxolitinib或BBI608,然后用烟曲霉菌感染小鼠角膜1天。使用裂隙灯观察拍照和荧光素染色评估小鼠角膜炎进展。对小鼠角膜炎进行临床评分。使用qRT-PCR和ELISA检测TSLP、IL-17A、IL-17F和IL-22在小鼠角膜组织中表达情况。3.研究结果3.1高通量测序结果表明JAK/STAT信号通路是烟曲霉菌诱导Th17炎症反应中发生变化最为明显的信号途径。进一步使用qRT-PCR对测序得到的JAK/STAT信号通路中主要分子进行验证。3.2使用烟曲霉菌刺激的DCs与CD4+T细胞共培养可以明显提高CD4+T细胞RORyt、p-JAK1、p-JAK2和p-STAT3蛋白表达水平。外源性rmTSLP同样可以提高上述蛋白水平。而敲低TSLP或TSLPR以后,烟曲霉菌刺激的DCs与CD4+T细胞共培养或rmTSLP处理均不能提高CD4+T细胞RORyt、p-JAK1、p-JAK2和p-STAT3蛋白表达水平。3.3在JAK1/JAK2抑制剂ruxolitinib或STAT3抑制剂BBI608存在的条件下,烟曲霉菌刺激的DCs或rmTSLP处理均不能促进CD4+T细胞中IL-17A、IL-17F和IL-22表达。3.4烟曲霉菌诱导的小鼠角膜炎模型中,结膜下预注射ruxolitinib或BBI608抑制小鼠真菌性角膜炎进展和角膜组织中IL-17A、IL-17F和IL-22表达。4.研究结论4.1烟曲霉菌刺激的DCs通过分泌TSLP激活CD4+T细胞中JAK/STAT信号通路。4.2烟曲霉菌刺激的DCs通过JAK/STAT信号通路诱导Th17型炎症反应。4.3烟曲霉菌通过JAK/STAT信号通路加剧小鼠真菌性角膜炎进展。第三部分cGAS-STING通路促进真菌性角膜炎免疫炎症反应机制研究1.研究目的本部分旨在研究cGAS-STING信号通路在烟曲霉菌刺激的HCECs以及小鼠真菌性角膜炎模型中的激活水平。明确cGAS-STING信号通路在烟曲霉菌诱导的HCECs炎症反应和小鼠真菌性角膜炎中的作用。2.研究方法2.1烟曲霉菌刺激HCECs 3、6、12和24小时,使用qRT-PCR和ELISA检测HCECs 中 TNF-α、IL-1β、IL-6 和 IFN-β 表达水平。2.2烟曲霉菌刺激HCECs 3、6和12小时,使用Western blot检测HCECs中cGAS、STING、p-STING、TBK1 和 p-TBK1 的蛋白水平,使用 ELISA 检测HCECs培养上清中cGAMP表达水平。2.3使用慢病毒转染方法构建稳定敲低cGAS的HCECs细胞系。烟曲霉菌刺激对照组和稳定敲低cGAS的HCECs 12小时,使用Western blot检测HCECs中cGAS、STING、p-STING、TBK1 和 p-TBK1 的蛋白水平,使用 qRT-PCR 和ELISA检测HCECs中TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-β表达水平。在稳定敲低cGAS的HCECs中再次转染PCMV-cGAS,烟曲霉菌刺激12小时,再次检测TNF-α、IL-1β、IL-6 和 IFN-β 表达水平。2.4在cGAS特异性抑制剂RU.521存在的条件下,使用烟曲霉菌刺激HCECs 12 小时,然后使用 Western blot 检测 HCECs 中 cGAS、STING、p-STING、TBK1和p-TBK1的蛋白水平,使用qRT-PCR和ELISA检测HCECs中TNF-α、IL-1β、IL-6 和 IFN-β 表达水平。2.5小鼠结膜下预注射RU.521或cGAS siRNA,然后使用烟曲霉菌感染小鼠角膜1天和3天。使用裂隙灯观察拍照、荧光素染色、H&E染色评估小鼠角膜炎进展。对小鼠角膜炎进行临床评分。使用ELISA检测角膜组织中cGAMP表达水平。使用免疫荧光检测小鼠角膜组织中p-STING和p-TBK1蛋白水平。使用qRT-PCR和ELISA检测小鼠角膜组织中TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-β表达水平。3.研究结果3.1 qRT-PCR和ELISA结果显示,烟曲霉菌促进HCECs中TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-β等炎症因子表达。3.2烟曲霉菌提高HCECs中cGAMP蛋白水平。Western blot结果显示烟曲霉菌以时间依赖的方式提高HCECs中cGAS、p-STING和p-TBK1的蛋白水平。3.3烟曲霉菌刺激条件下,稳定敲低cGAS的HCECs中cGAMP、cGAS、p-STING和p-TBK1的蛋白水平明显低于对照组。在敲低cGAS的HCECs中,烟曲霉菌不能提高细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-β的mRNA和蛋白水平。而再次过表达cGAS则恢复烟曲霉菌诱导的TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-β表达水平的升高。3.4 Western blot结果表明,在cGAS抑制剂RU.521存在的条件下,烟曲霉菌不能提高 HCECs 中 cGAS、p-STING 和 p-TBK1 的表达水平。qRT-PCR 和 ELISA结果显示,RU.521处理显着抑制烟曲霉菌诱导的HCECs中TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-β表达水平的升高。3.5烟曲霉菌诱导的小鼠角膜炎模型中,结膜下预注射RU.521或cGAS siRNA可以明显减缓小鼠角膜炎进展并且抑制烟曲霉菌感染诱导的小鼠角膜组织中cGAMP、p-STING和p-TBK1的蛋白水平的升高。qRT-PCR和ELISA结果显示,RU.521或cGAS siRNA也可以抑制烟曲霉菌感染诱导的小鼠角膜组织中TNF-α、IL-1β、IL-6 和 IFN-β 的表达。4.研究结论4.1烟曲霉菌感染激活HCECs和小鼠角膜组织中cGAS-STING信号通路。4.2烟曲霉菌感染通过cGAS-STING信号通路促进HCECs和小鼠角膜组织中炎症反应。4.3抑制cGAS活性减缓烟曲霉菌诱导的小鼠角膜炎进展。
李艳琦[3]（2021）在《TRIM26通过调控Th17细胞分化发挥抗真菌作用的机制研究》文中进行了进一步梳理当今世界艾滋病病毒等的流行、现代医学中的器官移植、对癌症患者进行化疗以及广泛应用的免疫抑制疗法导致出现许多免疫力低下的临床患者,这些免疫缺陷患者对真菌的抵抗力非常差,因此真菌能够引起危及生命的侵袭性感染,死亡率极高。但是目前临床治疗真菌感染只有屈指可数的几种药物,而且一些临床高发病率和高死亡率的侵袭性真菌病人耐药性的出现,迫切需要我们开发新的抗真菌药物和疗法。相对于抗病毒以及抗细菌的免疫机制研究,人们对于宿主抗真菌的免疫信号通路的研究知之甚少,从而制约了真菌防治疫苗与药物的研发,使真菌感染的控制在全球面临巨大挑战。当务之急,需要探究调控宿主免疫系统抵抗真菌感染通路的分子机制,为开发基于免疫治疗的新方法提供科学理论依据。当病原体入侵机体时,天然免疫是保护机体的第一道防线。宿主依靠真菌感染初期的天然免疫细胞表面的模式识别受体（PRR）非特异性识别真菌细胞壁表面糖蛋白等病原相关分子模式（PAMPs）,启动细胞内C型凝集素受体（CLRs）信号通路的激活,促进巨噬细胞和中性粒细胞等天然免疫细胞对白色念珠菌进行吞噬和杀伤,产生ROS、NO、水解酶等来抑制真菌的生长,同时激活NF-κB和MAPKs信号通路,促进炎症细胞因子释放,能够进一步加强天然免疫细胞并调控Th细胞的分化,激活宿主适应性免疫应答。适应性免疫也可通过细胞因子作用于天然免疫细胞,招募并增强某些天然免疫细胞的抗真菌功能。蛋白质的翻译后修饰在信号转导中发挥着重要作用,目前磷酸化在抗真菌免疫应答调控中的研究已经比较充分,而关于泛素化修饰在抗真菌免疫调控中的研究尚处于起步阶段。人类基因组中E3泛素连接酶的数目庞大,然而只有个别E3泛素连接酶在抗真菌免疫应答中的功能被研究报道,其它泛素连接酶是否也参与复杂的抗真菌免疫应答调控,还需要进一步挖掘。我们对TRIM家族大部分成员在抗真菌免疫反应中的作用进行了探究,前期研究发现,TRIM26基因敲除小鼠与WT相比在真菌感染后死亡率更高。TRIM26是E3泛素连接酶TRIM家族中的重要一员,在多种病理生理过程中通过其泛素化酶活性调控相关信号通路,有文献报道TRIM26在抗RNA病毒天然免疫中是负向调控作用,但其如何参与抗真菌免疫应答目前未被报道。我们的研究发现可能是由于TRIM26敲除后Th17分化增多,趋化因子CXCL1、CXCL2等的过量分泌招募过多的中性粒细胞,导致过度炎症反应,引起肾脏正常生理功能损伤,从而加快TRIM26敲除小鼠的死亡。TRIM26调控Th17分化的分子机制今后还需要更深一步的探究。研究目的:探讨TRIM26调控宿主抗真菌免疫应答的作用,以及TRIM26如何影响宿主免疫抗真菌反应的分子机制。研究方法:1.构建小鼠白色念珠菌系统感染模型选取6-8周龄的同窝生、体重大约在21.5 g的C57BL/6J品系的TRIM26敲除小鼠和WT小鼠各10只,通过尾静脉注射方法按照每只小鼠21.5 g的体重注射1 × 105个白色念珠菌（C.albicans）的剂量,每日在注射的同一时间点观察并测量记录小鼠的体重变化与死亡只数,统计并绘制小鼠体重变化曲线和生存曲线。2.探究TRIM26对白色念珠菌增殖的影响选取6-8周龄的同窝生、体重大约在21.5 g的TRIM26敲除小鼠和WT小鼠各4只,通过尾静脉注射方法按照每只小鼠21.5 g的体重注射1 × 105个白色念珠菌的剂量,第5天时无菌摘取肾脏、肝脏和脾脏,将其研磨匀浆后的组织浸出液按照比例涂布YPD平板,对长出的菌落数进行计数,计算组织载菌量,另一个肾脏进行切片,H&E、PAS、Ly-6G染色。3.探究TRIM26对免疫细胞发育的影响选取6-8周龄的同窝生WT和TRIM26敲除小鼠,在健康情况下采集小鼠的骨髓、脾脏、淋巴结以及胸腺,将其分离为单个细胞后,使用荧光标记的抗体组合对细胞表面标记 CD11b、CD11c、Ly-6G、Ly-6C、F4/80、MHC Ⅱ、CD3、CD4、CD8、NK1.1等进行染色,并应用流式细胞仪对各组免疫细胞的数目进行分析。4.探究TRIM26对天然免疫细胞杀菌功能的影响分离诱导WT和TRIM26敲除小鼠的BMDM和BMDC,与FITC标记的HKCA-Y按照一定比例共培养1h,之后收集细胞,流式检测各种免疫细胞对白色念珠菌的吞噬情况。小鼠腹腔巨噬细胞（PMs）、BMDMs、BMDCs、中性粒细胞,与白色念珠菌共培养4 h后裂解细胞,将裂解液按比例涂布YPD平板,37℃培养过夜后对长出的菌落数进行计数统计。BMDMs和BMDCs在HKCA-Y刺激下产生ROS,在细胞内装载FITC标记的检测探针后使用流式细胞仪检测ROS 的产生量。BMDMs 使用 HKCA-Y（MOI=10）刺激 Oh、24 h、48 h、72 h后收取细胞上清,利用亚硝酸盐检测试剂盒来检测上清中的亚硝酸盐以测定NO产生量。5.探究TRIM26对CLR通路介导的细胞因子表达的影响分离诱导WT和TRIM26敲除小鼠的BMDMs和BMDCs,在24孔板中铺板,使用 HKCA-Y（MOI=5）和 HKCA-H（MOI=2）刺激 Oh、2h、4h、6h 之后收集细胞,提取RNA,使用qRT-PCR方法检测IL-6、TNF-α、IL-1β的表达水平。6.探究TRIM26对白色念珠菌感染后免疫细胞募集的影响摘取WT和TRIM26敲除小鼠在感染白色念珠菌后第五天的肾脏,肾脏经胶原酶和DNase Ⅰ消化后,处理成单个细胞,使用荧光标记的抗体组合对细胞表面标记CD45、CD11b、Ly-6G、F4/80进行染色,以CD45+细胞作为门控对各组免疫细胞的数目进行分析。同时分离小鼠系统感染五天后的脾脏细胞,采用同样的方法进行流式检测。提取感染白色念珠菌后第五天的肾脏组织总RNA,qRT-PCR检测中性粒细胞激活因子和趋化因子的转录表达。7.探究TRIM26对Th1和Th17细胞分化的影响取TRIM26敲除小鼠和WT小鼠感染五天后的脾脏,研磨成单个细胞后在体外继续培养48 h,用加热致死的C.albicans（MOI=1）对脾细胞进行二次刺激,刺激结束后用荧光标记抗体组合对细胞表面标记CD3、CD4和细胞内标IL-17A、IFN-γ进行染色,之后用流式检测Th1和Th17的比例,同时收取细胞培养上清,ELISA检测IL-17A和IFN-γ的分泌水平。实验结果:1.TRIM26敲除小鼠对白色念珠菌抵抗力更低首先我们以实验室现有的TRIM家族不同基因敲除小鼠为研究对象,构建了白色念珠菌系统性感染模型,结果显示,相比于WT小鼠,TRIM26敲除小鼠在感染白色念珠菌之后,存活率显着降低,并且体重下降更明显,而TRIM65敲除小鼠在感染白色念珠菌后的存活率以及体重变化与WT小鼠相比,都没有统计学意义上的差异。说明TRIM26正向调控抗真菌免疫应答。2.TRIM26敲除小鼠清除白色念珠菌能力降低在小鼠进行系统感染后第五天摘取小鼠肾脏、肝脏和脾脏,取其组织研磨液涂布YPD平板,对长出的菌落数计数,计算组织载菌量,发现TRIM26敲除小鼠肾脏、肝脏和脾脏中真菌载量明显高于WT组,另一个肾脏进行切片,H&E、PAS染色,发现TRIM26敲除小鼠的肾脏组织有更严重的组织损伤,肾盂部位可见大量菌丝,验证了同样的结果。3.TRIM26敲除后不影响免疫细胞的发育对TRIM26敲除和WT健康小鼠的脾脏、骨髓、淋巴结以及胸腺组织来源的免疫细胞总数和比例进行流式检测分析,结果发现TRIM26敲除小鼠与WT小鼠相比,各组织来源的免疫细胞总数并无显着差异。流式检测脾脏来源的中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞百分比,结果显示均无差异;流式检测骨髓细胞中中性粒细胞、单核细胞和NK细胞百分比,结果发现也无差异;检测胸腺和淋巴结中CD4和CD8细胞的比例,结果显示TRIM26也不影响两者的发育。4.TRIM26不依赖固有免疫细胞的吞噬杀伤清除真菌我们使用流式检测TRIM26敲除和WT小鼠的BMDM和BMDC对FITC标记的白色念珠菌吞噬能力,YPD平板涂布法检测四种免疫细胞对白色念珠菌的杀伤能力,之后又对BMDMs的ROS和NO产量进行了检测,发现TRIM26的缺失并不影响固有免疫细胞对于真菌的吞噬和杀伤作用。5.TRIM26不影响CLR信号通路介导的细胞因子表达在诱导成熟的BMDMs和BMDCs中给予加热致死的酵母态（HKCA-Y）和菌丝态（HKCA-H）刺激,刺激相应的时间后,提取细胞的mRNA,使用qRT-PCR方法检测多种细胞因子的表达。结果显示BMDMs和BMDCs在接受两种不同刺激后,炎性细胞因子的表达都没有明显的差异。这些结果提示我们TRIM26不参与Dectin家族介导的CLR通路活化的调控。6.TRIM26敲除小鼠感染白色念珠菌后组织内中性粒细胞募集增多流式检测感染后五天肾脏组织募集的白细胞、髓系细胞以及巨噬细胞、中性粒细胞和CD4、CD8细胞的比例,发现TRIM26敲除小鼠肾脏中募集的白细胞、髓系细胞、中性粒细胞以及CD4+T细胞较WT小鼠比例更高,巨噬细胞和CD8+T细胞比例没有明显差异,肾脏切片的Ly-6G免疫组化染色也说明了中性粒细胞募集的增多。感染五天后的脾脏细胞用流式检测也发现中性粒细胞在TRIM26敲除小鼠脾脏的募集比WT更多,qRT-PCR方法检测感染五天后肾脏组织中中性粒细胞激活因子Ly6g、Mpo、S100a8,趋化因子CXCL1、CXCL2和CCL2,发现TRIM26敲除小鼠上述基因表达上调。体外分离的BMDMs中qRT-PCR方法检测CXCL1的mRNA水平,ELISA检测上清中CXCL1的分泌水平,发现趋化因子CXCL1都有一个明显的升高。7.TRIM26缺失小鼠感染白色念珠菌有更强的Th17免疫反应取小鼠白色念珠菌系统性感染五天后的脾脏给予加热至死的白色念珠菌二次刺激,用流式检测发现TRIM26敲除小鼠的脾脏细胞中的Th17细胞比例比WT有明显升高,但两者的Th1细胞比例没有明显差异。ELISA检测二次刺激后的细胞培养上清发现TRIM26敲除小鼠的脾脏细胞IL-17A的分泌水平明显上升,而TRIM26敲除小鼠IFN-γ的分泌量相较野生型小鼠没有明显差异。8.TRIM26敲除小鼠感染白色念珠菌较WT小鼠表现更严重的肾脏损伤对TRIM26敲除小鼠感染白色念珠菌5 d后的肾脏组织总RNA进行了qRT-PCR的检测,发现促炎细胞因子IL-6、TNF-α、IL1-β和肾脏损伤因子KIM-1、P-SELECTIN、ICAM-1、NGAL的mRNA水平都显着升高,而抑炎细胞因子IL-10转录表达下调。接着对于肾功能指标——肌酐和尿素氮的水平进行了检测,发现TRIM26敲除小鼠血清中肌酐和尿素氮水平较WT小鼠显着升高,说明肾功能遭到了破坏,从而导致在系统感染模型中,TRIM26小鼠死亡率更高。结论:1.我们发现了 TRIM26在白色念珠菌系统感染模型中起正向调控作用,发挥抗真菌功能。2.TRIM26具有防止真菌感染使Th17免疫反应过度增强的作用,从而抑制真菌感染引起趋化因子CXCL1等过度活化,抑制真菌感染靶器官招募过多的中性粒细胞,造成炎症损伤。
许知礼[4]（2021）在《白色念珠菌通过激活炎症信号途径在小鼠模型中诱导急性肺损伤的研究》文中研究说明研究背景白色念珠菌是一种常见于健康成人胃肠道、泌尿生殖道、口腔、皮肤和呼吸道的共生微生物,也是人类和其他哺乳动物的一种机会性真菌病原体。在多种条件下,如HIV/AIDS感染、广谱抗生素的过度使用、先天性免疫缺陷疾病、化疗和免疫抑制治疗,它可以从良性共生生物转变为致病病原体。据统计分析1997年至2016年期间侵入性念珠菌病仍主要由白色念珠菌感染引起。大约?的肺部念珠菌病患者需要入住重症监护病房或机械通气,与非白色念珠菌感染相比,总体住院死亡率显着升高。而且下呼吸道念珠菌定植会增加医院获得性肺炎发生率、增加耐药细菌感染风险,免疫受损患者合并念珠菌定植预后更差。支气管肺念珠菌病是侵入性念珠菌病的重要组成部分,但组织学证明的肺炎很少。因此,白色念珠菌导致肺损伤的机制有待于动物实验的进一步研究。目前研究发现,白色念珠菌感染会增加宿主促炎细胞因子和趋化因子的表达,抑制炎症信号通路可显着保护啮齿动物免受炎症诱导的急性肺损伤。核因子-κB（NF-κB）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）、信号转导和转录激活因子（STATS）通路是重要的炎症信号通路。然而,这些炎症信号通路是否参与小鼠白色念珠菌感染所致的急性肺损伤以及免疫抑制是否加重小鼠肺损伤仍需进一步探讨。研究目的1、探讨腹腔内注入地塞米松联合环磷酰胺是否可成功建立免疫抑制动物模型。2、探讨气道注入白色念珠菌是否可成功建立感染动物模型。3、探讨白色念珠菌感染是否诱导正常和免疫抑制小鼠急性肺损伤。4、探讨白色念珠菌感染导致正常和免疫抑制小鼠急性肺损伤的可能炎症机制。实验方法（1）白色念珠菌混悬液的制备取白色念珠菌标准菌株（ATCC SC5314）在YPD培养基30℃中培养过夜,使用倍比稀释涂布平板法将白色念珠菌混合配制成混悬液,调整菌量约为106～107CFU/ml。（2）免疫抑制动物模型建立地塞米松（Dexa,10mg/kg）i.p每天1次×10d,环磷酰胺（Cy,150 mg/kg）i.p每天1次×1d,成功制成免疫抑制模型;对照组于相同时间给予同等剂量生理盐水腹腔内注射。（3）感染动物模型建立免疫抑制模型建立次日,CA组和Dex A+Cy+CA组小鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.3m L/100g）后气管内注入50μl白色念珠菌混悬液。Control组和Dexa+Cy组小鼠麻醉后气管内注入50μl生理盐水。（4）流式细胞术Control组和Dexa+Cy组小鼠麻醉后利用眼球采血留取外周血行流式细胞术检查评估免疫抑制情况。（5）组织学白色念珠菌感染后6h处死所有小鼠,右肺上叶组织行组织培养,部分肺组织10%福尔马林浸泡,脱水石蜡包埋,切片HE染色和PAS染色。（6）ELISA法检测血清炎性因子IL-17、IL-6、IL-1β水平。RT-PCR法检测肺组织中IL-6、TGF-β、Kc和Mcp-1 m RNA水平。Western-blotting检测NF-κB、MAPK、PI3K/AKT和STAT3信号通路的蛋白表达。采用免疫组织化学方法检测NF-κBp65、NF-κBp50和p-STAT3的阳性核定位。（7）生存分析Control组、Dexa+Cy组、CA组和Dex A+Cy+CA组小鼠每组10只,动物死亡观察至白念珠菌感染后7d。研究结果1、腹腔内注射Dexa+Cy成功建立小鼠免疫抑制模型。雄性BALB/c小鼠腹腔内注射Dexa+Cy后表现为精神倦怠、萎靡,不喜活动,不嗜食水,毛发蓬乱,体重下降。小鼠外周血流式细胞术显示淋巴细胞比例下降,CD4+T和CD8+T细胞下降、CD4+T/CD8+T比值下降,免疫抑制模型构建成功。2、气管内注入白色念珠菌混悬液成功建立小鼠白色念珠菌感染模型。肺组织石蜡切片PAS染色显示肺组织内可见白色念珠菌孢子,肺组织培养可见白色念珠菌生长,白色念珠菌感染动物模型构建成功。3、白色念珠菌气管注入6小时后导致急性肺损伤,免疫抑制加重肺损伤。肺组织病理学Dexa+Cy组肺系数较Control组无统计学差异。CA组肺系数较Control组相比略有增加（P<0.05）。Dexa+Cy+CA组肺系数较Dexa+Cy组明显增加（P<0.01）。HE染色观察Control组和Dexa+Cy组显微镜下见肺泡结构完整,无炎症细胞浸润。CA组HE染色显微镜下见肺泡腔及间质可见大量炎症细胞浸润,伴有肺泡壁增厚。Dexa+Cy+CA组显着加重了小鼠肺中白色念珠菌诱导的炎症细胞浸润和肺泡壁增厚。4、白色念珠菌感染上调正常和免疫抑制小鼠肺部炎症因子和趋化因子的表达。正常和免疫抑制组小鼠白色念珠菌感染后,肺组织中炎症因子IL-6和TGF-βm RNA和趋化因子Kc和Mcp-1 m RNA显着增加。进一步测定血清IL-17、IL-6和IL-1β水平,CA组和Dexa+Cy+CA组三者水平显着升高,其中Dexa+Cy+CA组中IL-17和IL-1β水平较CA组进一步增高。5、白色念珠菌感染激活小鼠肺中NF-κB信号。核因子抑制蛋白IκBα在四组中表达水平无差异,但p-IκBα水平在白色念珠菌感染后显着升高。CA组肺NF-κB p50和p65的水平显着增加,免疫抑制后NF-κB p50和p65水平进一步增加。进一步分析肺NF-κB p50和p65的核移位发现NF-κB p50和p65的核移位主要在正常和免疫抑制小鼠的肺上皮细胞和间质细胞中,免疫抑制增加了白色念珠菌感染后κB p50和p65细胞核阳性的数量。研究结果显示白色念珠菌感染激活小鼠肺中NF-κB信号诱导急性肺损伤。6、白色念珠菌感染激活小鼠肺中MAPKs信号通路。研究显示四组之间肺p38、ERK1/2和JNK表达水平无差异。白色念珠菌感染对p-ERK1/2和p-JNK蛋白表达没有影响,但可显着诱导肺p38磷酸化,提示白色念珠菌感染可能通过MAPK-p38通路介导急性肺损伤。7、白色念珠菌感染激活小鼠肺中PI3K/Akt信号通路。研究发现正常和免疫抑制组小鼠肺中的p-Akt水平在白色念珠菌感染后明显上调的,提示白色念珠菌感染可以激活肺中的PI3K/Akt信号通路。8、白色念珠菌感染激活小鼠的肺STAT3信号通路。本课题分析了肺组织中的STAT3信号。结果发现白色念珠菌感染显着诱导肺STAT3磷酸化,免疫抑制小鼠的肺p-STAT3水平进一步升高。白色念珠菌感染后肺组织中ROR-γt和ROR-α水平显着升高。免疫抑制小鼠中p-STAT3细胞核阳性的数量增加。结果显示白色念珠菌感染可能活化小鼠的肺STAT3信号通路。研究结论（1）腹腔内注射Dexa+Cy成功建立小鼠免疫抑制模型。（2）气管内注入白色念珠菌混悬液成功建立小鼠白色念珠菌感染模型。（3）白色念珠菌感染上调正常和免疫抑制小鼠肺部炎症因子和趋化因子的表达。（4）白色念珠菌气道内注入可能通过激活NF-κB,MAPKs,PI3K/Akt和STAT3信号通路诱导急性肺损伤。免疫抑制可能通过激活部分炎症信号通路（NF-κB、STAT3）加重急性肺损伤。
赵婷[5]（2021）在《白头翁汤正丁醇提取物改善VVC小鼠阴道黏膜屏障及主要组分小檗碱抑制白念珠菌黏附阴道上皮的作用研究》文中指出目的:研究白头翁汤正丁醇提取物（Butyl Alcohol Extract of Baitouweng Decoction,BAEB）对外阴阴道念珠菌病（Vulvovaginal Candidiasis,VVC）小鼠阴道黏膜上皮屏障完整性的影响以及体外进一步探究其主要成分盐酸小檗碱对白念珠菌黏附人阴道上皮细胞的影响的作用机制。方法:1.SPF级雌性昆明种小鼠皮下隔天注射苯甲酸雌二醇3次诱导至假发情期;并将其随机分为6组（空白对照组,氟康唑组,模型组,BAEB高、中、低剂量组）;除去空白对照组以外,其余各组小鼠均以每只20μl菌液(2×106 CFU·ml-1)接种白念珠菌Candida albicans SC5314标准株至小鼠阴道,悬空倒立5 min,连续7天以构建VVC模型。再用BAEB（80 mg/kg、40 mg/kg、20 mg/kg）按对应组别分别灌胃,连续治疗7天。BAEB治疗后,革兰染色观察白念珠菌在小鼠阴道分泌物中的形态;平板法检测小鼠阴道内的真菌载荷量;HE（Hematoxylin-eosin staining）染色法观察小鼠的阴道黏膜组织病理损伤;MT（Masson’strichrome staining）,HE及PAS（Periodic acid-schiff staining）染色法观察小鼠阴道黏膜上皮屏障的完整性;免疫组化法检测小鼠阴道黏膜上皮细胞黏蛋白mucin-1、mucin-4及β-防御素2蛋白表达水平;Western blot法检测第0,3,7天黏膜上皮细胞黏蛋白mucin-1、mucin-4及β-防御素2的动态表达。2.体外观察BAEB的主要组分盐酸小檗碱对白念珠菌对人阴道上皮细胞A431早期黏附的影响。CCK8检测A431细胞的最适生长浓度、盐酸小檗碱对细胞活力的影响;显微镜观察细胞的汇合度及形态变化;革兰染色法观察1 h、2 h、3 h白念珠菌早期黏附细胞的动态变化及盐酸小檗碱干预后对白念珠菌早期黏附A431细胞的动态影响;ELISA检测白念珠菌刺激下细胞上清液IL-2、IL-4的水平变化及IL-2/IL-4的动态比例;免疫荧光观察白念珠菌刺激下细胞膜上黏附分子ICAM-1的动态表达;Western blot检测白念珠菌刺激下A431细胞黏附分子ICAM-1、黏蛋白（mucin-1、mucin-4）的动态变化。结果:1.革兰染色与平板涂布发现模型组比空白对照组小鼠阴道内的白念珠菌菌丝量多、密集、且较长以及高真菌载荷量;HE染色、MT染色及PAS染色观察到VVC模型组小鼠阴道黏膜结构严重受损,角化层脱落,上皮细胞出现增生,炎症浸润加剧;免疫组化定位与Western blot定量均检测到阴道上皮细胞表面黏蛋白mucin-1、mucin-4及β-防御素2蛋白的表达量显着增多（p<0.0001）;VVC小鼠经BAEB治疗后,与模型组相比,BAEB（高、中、低剂量组）小鼠阴道内菌丝的形成明显受到抑制,真菌载荷量显着下降（p<0.05）;炎症浸润相应降低,阴道黏膜组织损伤也逐渐改善,上皮屏障修复并恢复其完整性;阴道上皮细胞表面的黏蛋白mucin-1、mucin-4及β-防御素2蛋白水平显着下调（p<0.001）。2.CCK8检测和倒置显微镜形态学观察表明,2×105个/ml细胞为A431细胞最适生长密度,且细胞铺展较大,胞间连丝紧密,褶痕突出,漂浮物极少。革兰染色结果表明白念珠菌在早期黏附时间及不同菌的浓度下,2 h时2×107CFU·ml-1的白念珠菌黏附A431细胞的量最多（p<0.0001）。ELISA检测表明较正常组细胞模型组的IL-2分泌增加,上升幅度极大,IL-4分泌也增加,但幅度极小;而盐酸小檗碱干预后IL-2分泌明显下调,IL-4分泌显着上调。免疫荧光结果表明,较正常组细胞,模型组的黏附分子ICAM-1表达显着增加（P<0.0001）且2h ICAM-1的表达量最多;盐酸小檗碱干预后,ICAM-1表达显着降低（P<0.0001）。Western blot结果表明,较正常组细胞,模型组的黏附分子ICAM-1、mucin-1和mucin-4表达显着增加,且具有短暂的时间依赖性;而盐酸小檗碱干预后,ICAM-1、mucin-1及mucin-4的表达较模型组均显着降低。结论:本实验成功构建了小鼠外阴阴道念珠菌病（VVC）模型,并发现BAEB对VVC小鼠的治疗与阴道上皮屏障的修复及黏膜完整性的重塑密切相关,其作用机制可能通过调节机体的固有免疫相关免疫分子mucin-1、mucin-4及β-防御素2等的表达而实现。体外实验表明,BAEB的主要成分盐酸小檗碱在低于其MIC浓度时,能够抑制白念珠菌对阴道上皮细胞的早期黏附和损伤,降低IL-2的分泌同时促进IL-4的分泌,并下调黏附相关分子ICAM-1及黏蛋白mucin-1、mucin-4的表达,从阴道上皮细胞及相关免疫分子角度进一步阐明了BAEB抗VVC的作用与机制。
李晓丹[6]（2020）在《雌二醇调控绵羊输卵管黏膜上皮细胞S100A8和A9表达的机制研究》文中认为输卵管黏膜维护了输卵管腔配子运输和胚胎发育的内环境,而感染或慢性炎症造成的黏膜损伤和免疫功能失调,会引起输卵管疾病并会导致雌性动物生产、生殖能力下降。雌激素对输卵管免疫稳态具有重要的调控作用,本研究通过转录组分析筛选雌激素调控输卵管黏膜免疫功能的关键因子,并进一步探究其受调信号通路和免疫调节作用。本研究补充了雌激素对输卵管黏膜免疫的调控分子机制,并对于输卵管炎症损伤的恢复有指导作用。研究内容如下:RNA-seq检测输卵管上皮细胞在10-8M 17 β-雌二醇（E2）作用0h、1.5h、3.5h、5.5h后差异表达基因。结果显示,输卵管黏膜上皮细胞经E2处理后不同时间组显着差异表达基因呈动态变化,差异基因最多达到324个。GO功能富集分析表明,差异基因富集在细胞增殖分裂、细胞分化、细胞连接、免疫和炎症反应等相关功能中,其中富集在免疫相关功能中的差异基因包括S100A8、S100A9、S100A12、PTX3、LBP、NUPR1、CXCR4 等,且不同作用时间 S100A8、S100A9、CXCR4的变化显着两两相关。KEGG分析表明差异基因在细胞因子信号通路、MAPK信号通路、白细胞跨内皮迁移、钙信号、花生四烯酸代谢等通路富集。免疫组织化学检测发现健康间情期的绵羊输卵管黏膜上皮中丰富表达S100A8和S100A9。之后利用10-8M E2在不同时间（5h、6h、7h、8h）作用输卵管上皮细胞,q-PCR检测发现S100A8和S100A9在作用7h后相比对照组显着升高并达到峰值,且不同 E2 浓度（10-5M,10-6M,10-7M,10-8M,10-9 M）对 S100A8和S100A9均有上调作用,其中10-7M和10-8M组S100A8和S100A9的表达量最高,但两组之间差异不显着。免疫细胞化学法同样显示S100A8和S100A9在10-8 M E2作用7h后相比对照组表达升高。三种受体抑制剂或组合作用输卵管上皮细胞,q-PCR及WB法检测S100A8和S100A9的表达变化。结果显示ER拮抗剂Tamoxifen、Fulvestrant与GPER抑制剂G-15对S100A8和S100A9的表达均有抑制作用,所以E2是通过同时激活经典受体ER和膜受体GPER,共同上调靶基因S100A8和S100A9的表达。之后MAPK三个激酶家族抑制剂或组合作用输卵管上皮细胞,q-PCR及WB法检测S100A8的表达变化。发现JNK抑制剂SP600125对S100A8的表达有明显的抑制作用,而P38 MAPK抑制剂SB203580及ERK1/2抑制剂U0126在mRNA和蛋白质水平上没有表现出对S100A8的抑制作用。最后检测几种雌激素受体抑制剂或组合对E2作用下输卵管上皮细胞JNK的作用,发现ER抑制剂Tamoxifen、Fulvestrant与GPER抑制剂G-15都可抑制JNK的激活,说明E2能够通过不同膜受体ER和GPER激活JNK。综上所述,E2可通过不同的mER（ER、GPER）激活JNK进而影响S100A8的表达。通过双g-RNA CRISPR/Cas9技术敲低输卵管黏膜上皮细胞中的S100A8基因,并检测相关免疫因子IL-1β、IL-10的变化。结果显示S100A8的敲低会导致IL-10降低和IL-1β的升高,说明生理情况下S100A8在一定程度上调抗炎因子IL-10和下调炎症因子IL-1β,维持输卵管的免疫稳态。S100A8基因敲低后,雌激素可上调IL-10的水平,这可能是S100A8功能缺失的代偿机制,并对下游因子IL-1β产生负反馈调节。
张成臻[7]（2020）在《一株分离自慢性复发性颈部淋巴结炎患者的白念珠菌的微生物学特征及其机制研究》文中指出背景和目的白念珠菌（Candida albicans）是人类的共生菌,现在也被认为是人类最重要的机会性致病真菌。根据宿主不同的免疫状态,白念珠菌能引起浅部感染、深部感染甚至念珠菌血症。慢性念珠菌病主要表现为慢性皮肤黏膜感染,多发生在免疫异常或免疫缺陷人群中,给患者带来很多困扰。然而,慢性或复发的临床浅表真菌感染机制仍不清楚。在前期实验中,我们对一株由颈淋巴结炎患者淋巴结内分离出的白念珠菌进行研究。患者反复出现局限性白念珠菌性颈淋巴结炎10余年,无其他特殊病史,免疫学指标低下。予以抗真菌药物及胸腺肽注射后患者情况好转,但多次复发。在前期的实验中我们发现这株白念珠菌在形态学、毒力、侵入及耐药方面有着显着的差异,将进一步研究白念菌丝发育与共生及耐药的分子机制,以期揭示其形态异常与长期定植的分子机制,为根治白念珠菌深部慢性感染提供新的思路和理论依据。方法本研究通过镜检形态,CHROMagar念珠菌显色平板及分子检测PCR技术对ITS区域进行测序将JL01准确鉴定到种。通过应激反应试验,将JL01以及标准株SC5314以10倍稀释的方法点在含有不同抗真菌试剂、DNA损伤试剂及细胞壁损伤试剂等YPD平板上,观察不同菌株对不同试剂的耐受能力。利用血清条件、李氏培养基、Spider培养基和不同碳源、氮源等条件诱导此菌株菌丝发育,通过光学显微镜、共聚焦显微镜等多方面观察比较不同诱导条件下此菌株的形态转换差异。通过包埋试验及侵入试验探究此菌株在缺氧环境下侵入培养基的生长能力。建立白念珠菌系统感染的小鼠模型,通过分析小鼠感染JL01菌株后的小鼠死亡率以及各种组织的病理变化,分析JL01菌株的毒力强弱及播散能力。研究该临床菌株感染宿主过程中的作用,通过检测细胞因子在感染菌株后宿主细胞的表达量,观察菌株在感染及共生时免疫逃逸的能力。分别用JL01菌株及白念标准菌株感染不同细胞,在0h,0.5h,1h,2h,4h通过共聚焦显微镜观察菌株逃逸情况。采用RNA高通量测序分析（RNA-seq）、实时定量PCR（RT-q PCR）方法对JL01异常耐药、形态、毒力以及免疫逃逸相关的分子机制进行初步研究。结果1.菌株鉴定CHROMagar显色平板试验及ITS测序将JL01准确鉴定为白念珠菌。2.形态学观察结果JL01在多种菌丝诱导条件下均无法形成真菌丝,呈现假菌丝形态。低氧条件无法诱导JL01产生菌丝。侵入生长试验证实JL01侵入生长能力明显弱于SC5314。在体外培养的条件下JL01对氧化应激,渗透压力及唑类抗真菌药物的耐受能力明显增强。3.JL01菌株毒力测试JL01在系统性感染模型中毒力明显减弱,尤其低浓度感染条件下几乎不导致小鼠死亡。而感染JL01小鼠各个组织器官中的真菌负荷量明显增多。宿主组织中细胞因子和趋化因子的表达量则明显下降。4.体外实验研究JL01菌株与标准株在被BMDM吞噬后逃逸的差异BMDM与JL01共培养2 h后,巨噬细胞将JL01细胞吞入其中,而JL01呈酵母样,共培养4 h后,部分JL01细胞发育成假菌丝形态,突破BMDM细胞膜,伸出细胞外。BMDM与SC5314共培养2 h时,SC5314细胞即形成芽管并逐渐延长,至4 h时突破巨噬细胞。5.形态学相关分子机制的初步研究RNA-Seq分析结果显示,在JL01中421个基因与SC5314相比有显着差异,其中216个基因显着上调,205个基因显着下调。进行GO富集分析结果显示,有显着差异的基因主要集中在分子功能和生物学进程中,包括发病机理、细胞黏附、菌丝生长及应激能力。进一步的q RT-PCR实验证实,JL01的多种菌丝特异性基因表达显着降低（如ECE1,HWP1及ALS3）与菌株形态学观察结果相一致,免疫逃逸（SAP6,VPS11及SSD1等）及抵抗氧化应激基因（HPS12,HOG1及CEK1等）表达则显着增加。结论本研究首次鉴定了一株来源于反复复发的白念珠菌颈部淋巴结炎患者的Candida albicans临床株JL01,它和对照菌SC5314相比,对唑类药物的耐药性增强,菌丝发育有显着缺陷,而且不能良好的激活宿主免疫应答。并且在形态学以及耐药相关的分子调控机制等方面有明显的不同。为揭示慢性复发性念珠菌感染的机制研究提供基础,为其治疗提供可能的研究靶点。
李宁[8]（2020）在《银屑灵调节朗格汉斯细胞和T helper细胞的作用及机制研究》文中研究表明背景:银屑病（Psoriasis）是一种常见的慢性炎症性皮肤病,以炎症浸润、表皮棘皮病和角化过度为特征。银屑病的发病机制复杂,现有的研究结果尚不能完全解释。目前普遍认为银屑病是由多种原因包括遗传、表观遗传和环境影响等共同作用的结果。银屑病的皮损表现为角质细胞过度增殖和分化不全,炎症细胞浸润,毛细血管增生等。最近的研究表明银屑病主要是由树突状细胞（Dendritic cell,DC）和T细胞介导的,朗格汉斯细胞（Langerhans cell,LC）作为特殊的DC,是皮肤的特异性抗原提呈细胞,通过连接模式识别受体感知病原体相关分子,产生多种细胞因子,并携带抗原呈递给T细胞,诱导特异性T细胞反应,DC失调引起的T细胞异常激活被认为是多种疾病特异性免疫反应的原因,如银屑病。中医药认为治疗银屑病应“从血论治,从燥论治”,各方名家基于此理论,针对其特性总结出的疗法疗效可靠,毒副作用少。银屑灵是国医大师禤国维教授根据多年临床经验总结出的验方,方中主要有赤芍、土茯苓、肿节风、莪术和乌梅五味中药,诸药合用可养血润燥,凉血解毒,化瘀通络,在临床上取得了可靠的疗效。前期研究显示银屑灵可促进表皮颗粒层的形成,减轻小鼠瘙痒程度以及小鼠皮肤风团的面积,还能够抑制巨噬细胞极化,但是就银屑灵对LC及T细胞的调控研究较少,因此本实验从LC和T细胞方面对银屑灵的免疫调节机制进行研究。目的:探讨银屑灵对朗格汉斯细胞和T辅助细胞的调节作用及机制;并进一步对银屑灵的主要有效成分花旗松素治疗银屑病的疗效和对T辅助细胞的作用及机制进行研究。方法:1.Balb/c小鼠银屑病模型的建立及银屑灵疗效的观察Balb/c小鼠随机分为6组,包括空白组、模型组、环孢素A组和银屑灵高、中、低组,并剃掉小鼠背部2/3的毛发。小鼠灌胃给药7天,银屑灵高、中、低剂量组给药浓度分别为1.5g/kg、1g/kg、0.5g/kg,环孢素A组为2mg/mL,均按照0.2mL/10g的剂量给药,空白组和模型组给同等剂量的水。给药第三天开始于背部均匀涂抹5%咪喹莫特（IMQ）50mg,连续涂抹5天,每日记录体重。造模第二天开始观察小鼠背部红斑、鳞屑和增厚等症状,并对其进行PASI评分;造模第六天取背部皮肤进行HE病理切片,观察皮损病理变化,并结合PASI评分和体重变化评价银屑灵药效。2.银屑灵对LC的调控作用研究小鼠灌胃给药五天,第四天开始涂抹IMQ造模,第六天深度麻醉后,颈椎脱臼处死,取皮肤和淋巴结分离表皮细胞和淋巴细胞,采用流式对表皮及淋巴细胞中LC的表达情况进行检测分析。3.银屑灵对T细胞的作用研究小鼠灌胃给药七天,第三天开始涂抹IMQ造模,第八天深度麻醉后,颈椎脱臼处死,皮肤做病理切片,观察银屑灵对银屑病CD3+CD4+T细胞浸润的影响;采用RT-PCR检测皮肤中Th1/Th2/Th17细胞因子IFN-γ、IL-4和IL-17a以及转录因子T-bet、GATA3和ROR γt的表达;采用流式细胞术检测淋巴细胞和表皮细胞中T细胞相关细胞因子和转录因子的表达,观察银屑灵对银屑病表皮T细胞产生细胞因子以及淋巴结T细胞分化的影响。4.银屑灵主要有效成分花旗松素对银屑病的作用及机制研究利用LPS诱导HaCat细胞异常增殖,观察花旗松素对Hacat细胞异常增殖的作用;小鼠按照TXL组40mg/kg,CsA组2mg/mL灌胃给药七天,第三天开始用50mg 5%IMQ造模,第八天深度麻醉后,颈椎脱臼处死,皮肤做病理切片观察皮肤厚度,层数以及炎性细胞浸润程度;采用RT-PCR和流式细胞术对皮损和淋巴结中Th1/Th2/Th17的细胞因子及其转录因子进行检测分析;皮肤提取蛋白做Western Blot检测,探讨TXL缓解银屑病症状的分子机制。结果:1.Ba1b/c小鼠背部连续涂抹50mg 5%咪喹莫特五天,其背部出现严重红斑、鳞屑和增厚等银屑病症状,PASI评分达到11.00±0.82,皮肤厚度275.54±14.64μM,体重增加率-8.87%±1.63%。而银屑灵给药后银屑病样皮损明显缓解,中剂量组PASI评分降低至6.25±1.71（P<0.05）,体重增加率-2.39%±1.72%（P<0.01）,表皮厚度也明显变薄148.97±6.60 μM（P<0.001）,说明银屑灵能够有效缓解银屑病临床症状和病理症状。2.流式结果显示,银屑灵组PU.1和LC的表达均显着降低（P<0.001）,说明银屑灵可以抑制表皮LC和PU.1的表达,但不影响淋巴结中DC的表达水平（P>0.05）;另外银屑灵组迁移至淋巴结的LC 比值为2.17±2.47%,而IMQ组为40.60±7.66%,说明银屑灵能够抑制LC从表皮迁移至淋巴结（P<0.001）,同时,检测结果还表明银屑灵能够抑制LC发挥抗原提呈作用（P<0.05）,因此银屑灵可能通过抑制LC的迁移及其抗原提呈作用来缓解银屑病。3.银屑灵降低了银屑病皮损CD3+CD4+T细胞的浸润,降低了促炎因子IL-17a和IFN-γ的表达（P<0.05）,同时促进了抗炎因子IL-4的分泌（P<0.05）;淋巴结中T细胞流式结果显示,银屑灵对TCR β+T细胞和CD4+T细胞的比值作用不明显（P>0.05）,但是显着降低了产生IL-17a的 γδ+T细胞的表达（P<0.05）;另外银屑灵抑制了 Th1细胞和Th17细胞的主要细胞因子IL-17a和IFN-γ的分泌（P<0.001）,但是对其转录因子ROR γT和T-bet影响不明显（P>0.05）,相反对Th2细胞因子IL-4及其转录因子GATA3有明显的促进作用（P<0.01）,因此银屑灵可能通过促进抗炎性Th2细胞反应,同时抑制促炎性Th1和Th17细胞而发挥治疗作用。4.花旗松素能够有效抑制LPS诱导的HaCat细胞的异常增殖（P<0.001）,并能够有效缓解小鼠银屑病样临床及病理症状（P<0.05）。花旗松素降低了促炎因子IL-17a和IFNγ及其转录因子ROR γt和T-bet的表达（P<0.01）,同时对抗炎因子IL-4及其转录因子GATA3有明显促进作用（P<0.001）。Western Blot结果显示,花旗松素能够抑制Notch1,RBPJK,JAK2和p-stat3的表达（P<0.05）。因此,TXL可能通过调节Notch1通路和JAK2/stat3通路促进抗炎因子IL-4及其转录因子GATA3的表达,降低了促炎因子IL-17a和IFN γ及其转录因子ROR γt和T-bet的水平,从而起到缓解银屑病的作用。结论:1.灵可有效缓解银屑病临床及病理症状,降低其PASI评分,有效恢复体重;2.灵明显降低LC及其转录因子PU.1的表达,抑制LC的迁移及其抗原提呈作用;3.着降低小鼠皮损CD3+CD4+T细胞的浸润,促进淋巴结Th2细胞的分化,同时抑制Th1和Th17细胞的分化;4.松素可有效抑制LPS诱导的HaCat细胞异常增殖,缓解银屑病临床及病理症状,通过抑制Notch1和JAK2/STAT3通路促进Th2细胞,同时抑制Th1和Th17细胞的表达。
闫尊强[9]（2019）在《C型产气荚膜梭菌性腹泻仔猪脾脏lncRNA、mRNA和miRNA测序及功能分析》文中指出腹泻是导致仔猪死亡的常见传染性肠道疾病,对养猪业造成了极大的经济损失,已成为阻碍养猪业健康发展的绊脚石。C型产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens type C,C.perfringens type C）是引起仔猪细菌性腹泻的常见病原菌之一,该菌经消化道感染仔猪,在其肠道中大量繁殖,所产生的毒素破坏肠道组织并经体液循环系统运输而损害远端器官（如脾脏）,从而引起仔猪腹泻及全身性器官的损伤。接种疫苗和使用抗生素可一定程度上减少并控制仔猪C型产气荚膜梭菌性腹泻的发生,但无抗和绿色健康养殖成为未来养殖业发展的方向之一,养殖过程中需尽可能减少药物对环境的污染以及猪只对疫苗和药物的依耐性。另外,脾脏lncRNA（long non-coding RNA）、mRNA和miRNA（microRNA）在大肠杆菌和沙门氏菌引起仔猪腹泻的过程中起重要调控功能,然而有关脾脏lncRNA、mRNA和miRNA在仔猪感染C型产气荚膜梭菌导致腹泻的调控机制研究较少。因此,从仔猪腹泻的调控机制着手,找出抵抗C型产气荚膜梭菌的相关分子,培育出抵抗C型产气荚膜梭菌的猪品系将成为防治仔猪腹泻的新途径。本研究选取30头7日龄仔猪为研究对象,随机选取5头仔猪作为对照组（SC）,其余25头仔猪进行C型产气荚膜梭菌口服攻毒试验,根据腹泻总评分（由低到高）挑选前5头和后5头仔猪分别作为耐受组（SR）及易感组（SS）,进一步利用RNA-Seq技术对SC、SR和SS三组仔猪脾脏组织进行测序及生物信息学分析,获得SC、SR和SS三组仔猪脾脏差异表达的lncRNA、mRNA和miRNA分子,并对这些差异表达分子进行GO功能和KEGG信号通路富集分析,对重要的信号通路和关键分子进行系统研究,以期为揭示lncRNA、mRNA和miRNA在C型产气荚膜梭菌性腹泻过程中的调控机制提供参考。主要研究结果如下:（1）对拼接得到的184539条转录本进行后续筛选,在SC、SR和SS三组中共得到2056个新lncRNA（novel lncRNA）,包括1811个基因间型lncRNA（large intergenic lncRNA,lincRNA）和245个反义型lncRNA（antisenselncRNA）,鉴定到了2144个已知lncRNA（annotated lncRNA）和4324个新mRNA（novel mRNA）。（2）鉴定出的新lncRNA与数据库ALDB中已知lncRNA具有非常相似的基因组特征,与已注释的蛋白编码基因相比较,这些新lncRNA具有更少的外显子数、较长的转录本、更短的开放阅读框、较低的表达量、更低的蛋白编码潜能和序列保守性不强等特点。（3）使用miRNA测序方法在15个脾脏样本中共获得338条已知miRNA成熟体（mature miRNA）,对应295条miRNA前体（Pre-miRNA）,得到514条新miRNA成熟体（novel mature miRNA）,对应257条miRNA前体。（4）SC、SR和SS三组仔猪脾脏差异表达lncRNA、mRNA和miRNA的层次聚类图发现感染C型产气荚膜梭菌的SR和SS两组仔猪聚类在一起,说明两组的表达模式较为相近。（5）仔猪C型产气荚膜梭菌抗性和易感性个体间筛选出了19个差异表达lncRNA（上调9个和下调10个）,基于cis和trans机制对这些差异表达lncRNA的靶基因进行了预测,cis机制预测出C型产气荚膜梭菌抗性和易感性仔猪个体间差异表达lncRNA上下游共存在23个靶基因,trans机制预测出93个与差异表达lncRNA存在显着相关性的靶基因;靶基因富集的GO功能主要有自然杀伤性T细胞的激活（NK T cell activation）、2型免疫反应的调控、（Regulation of type 2 immune response）、抵抗细菌（Defense response to bacterium）等,靶基因富集的KEGG信号通路主要包括自噬调控（Regulation of autophagy）、A型流感（Influenza A）、炎症性肠道疾病（Inflammatory bowel disease）等,差异表达lncRNA靶基因富集的这些GO功能和KEGG信号通路与C型产气荚膜梭菌性腹泻密切相关。（6）仔猪C型产气荚膜梭菌抗性和易感性个体间筛选出了123个差异表达mRNA（上调43个和下调80个）,差异表达mRNA主要富集在与免疫应答、疾病相关的GO功能和KEGG信号通路,如GO功能有免疫系统生物学过程（Immune system process）、防御反应（Defense response）、先天性免疫应答（Innate immune response）、抵抗病毒（Response to virus）;KEGG信号通路有阿米巴病（Amoebiasis）、A型流感（Influenza A）、荨麻疹（Measles）、军团杆菌病（Legionellosis）、细胞核因子酉乙蛋白（NF-kappa B）等,这些GO功能和KEGG信号通路可能与仔猪对C型产气荚膜梭菌的易感性和抗性有关。（7）仔猪C型产气荚膜梭菌抗性和易感性个体间筛选出了56个差异表达miRNA（上调21个和下调35个）,这些miRNA靶基因主要富集在免疫T细胞增殖（Immature T cell proliferation）、防御应答调控（Regulation of defense response）等GO功能,这些差异表达miRNA可能调控靶基因在仔猪感染C型产气荚膜梭菌过程中起关键作用。（8）结合靶基因预测和功能分析,筛选出了2个与C型产气荚膜梭菌抗性相关的重要lncRNA,即ALDBSSCT0000006918和ALDBSSCT0000007366,均位于猪第3号染色体上,属于lincRNA类型,这两个lncRNA靶基因（如GADD45G、IL12A）富集的KEGG信号通路有丝裂原活化蛋白激酶（Mitogenactivated protein kinase,MAPK）、Toll样受体（Toll like receptor）等,说明SR与SS组间差异表达的ALDBSSCT0000006918和ALDBSSCT0000007366靶向调控其靶基因参与这些免疫信号通路来抵抗C型产气荚膜梭感染。（9）结合靶基因预测和功能分析,筛选出了4个与C型产气荚膜梭菌密切相关的关键miRNA,即miR-133b、miR-532-3p、miR-339-5p和miR-331-3p,其中SR组下调表达的miR-133b与上调表达的miR-532-3p能调控其靶基因NFATC4的表达水平,SS组上调表达的miR-339-5p和miR-331-3p能调控靶基因TNFAIP8L2的表达量,miR-339-5p靶向调控基因HTRA3的表达量,进而影响下游免疫基因和细胞因子基因的表达,这些腹泻抗性相关miRNA可能调控C型产气荚膜梭菌引起仔猪腹泻的免疫反应,是仔猪抵抗该病菌的关键靶点。总之,我们研究了C型产气荚膜梭菌抗性和易感性仔猪脾脏中差异表达lncRNA、mRNA及miRNA分子,经过生物信息学预测及功能分析,挖掘出了2个关键lncRNA（ALDBSSCT0000006918和ALDBSSCT0000007366）及4个重要miRNA（miR-133b、miR-532-3p、miR-339-5p和miR-331-3p）,它们与抵抗C型产气荚膜梭菌感染仔猪的生物学过程密切相关,今后需在细胞水平进一步验证它们的具体调控机制,该研究为培育出抵抗C型产气荚膜梭菌的猪品系提供了一定的理论依据。
张曼[10]（2019）在《酿酒酵母β-葡聚糖对绵羊瘤胃上皮细胞和外植体内β-防御素-1表达影响的研究》文中研究说明绵羊瘤胃作为反刍动物的第一个胃,经常会受到各种病原微生物的挑战。绵羊瘤胃黏膜上皮在先天性免疫中发挥重要作用,并可以分泌一系列先天免疫分子来防止微生物的侵袭。防御素是一种由黏膜上皮产生并具有广谱抗微生物活性的阳离子肽,被认为是抗生素的潜在替代品。本课题组先前的研究表明酿酒酵母全细胞壁能够上调绵羊瘤胃上皮细胞（Ovine ruminal epithelial cells,ORECs）内 β-防御素-1（Sheepβ-defensin-1,SBD-1）的表达,为了进一步确定酿酒酵母细胞壁诱导SBD-1表达的有效成分,本研究选用来源于酿酒酵母细胞壁的β-葡聚糖刺激ORECs以观察其对SBD-1表达的影响,并进一步研究此诱导过程可能涉及的信号通路。外植体培养具有在受控环境中保留与体内相似的组织学特征等特点,因此外植体培养相对于细胞而言更接近于体内环境。本研究探索了绵羊瘤胃外植体（Ovine ruminal explants,OREs）培养的可行性和最佳条件,并在此基础上研究β-葡聚糖对OREs内抗菌肽SBD-1、促炎细胞因子IL-6和抗炎细胞因子IL-10表达的影响。具体研究内容及结果如下:（1）用不同浓度（0、5、10、20、50和100 μg/mL）的β-葡聚糖刺激ORECs 8 h后,利用qPCR和ELISA方法检测SBD-1的表达变化,从而筛选出诱导SBD-1表达最佳的β-葡聚糖浓度,而后用此浓度刺激ORECs不同时间（0、2、4、8、12和24 h）,同样采用qPCR和ELISA方法筛选出诱导SBD-1表达的最佳时间。结果显示:10μg/mL的β-葡聚糖分别刺激ORECs 2和4 h时SBD-1 mRNA和蛋白表达最大。（2）采用Western blot、RT-PCR、免疫组化、免疫荧光、qPCR和ELISA方法检测β-葡聚糖诱导SBD-1表达上调的信号通路。结果表明树突状细胞相关C型凝集素 1（Dendritic-cell-associated C-type lectin 1,Dectin-1）和脾脏酪氨酸激酶（Spleen tyrosine kinase,Syk）在绵羊瘤胃黏膜组织及ORECs内表达,并且用siRNAs干扰或抑制剂抑制Dectin-1、Syk、TLR-2和MyD88表达后减弱了β-葡聚糖诱导的SBD-1表达。用β-葡聚糖处理ORECs导致p38、JNK、ERK1/2和NF-κB表达显着增加,而用抑制剂抑制MAPK和NF-κB途径显着降低了 β-葡聚糖诱导SBD-1的表达,且NF-κB抑制剂效果最明显。（3）培养OREs,并采用H.E染色、qPCR和免疫组化等方法检测OREs的组织结构完整性及细胞活性。H.E染色结果显示:不添加血清的培养基内OREs组织结构更完整。qPCR和免疫组化结果显示:培养24 h以内的OREs E-cadherin的表达与未培养的组织差异不显着,且存在CK-18和Ki-67的阳性信号。（4）将OREs与不同浓度（0、10、50、100、200和400 μg/mL）的β-葡聚糖共培养8 h后,采用qPCR和ELISA方法检测SBD-1、IL-6和IL-10的表达变化,从而筛选出诱导SBD-1、IL-6和IL-10表达最佳的β-葡聚糖浓度,而后用此浓度刺激ORECs不同时间（0、2、4、8、12和24 h）后,同样采用qPCR和ELISA方法筛选出诱导SBD-1、IL-6和IL-10表达的最佳时间。结果显示:50 μg/mL的β-葡聚糖分别刺激OREs 2、8 和 12 h 时 SBD-1、IL-6 和 IL-10 的 mRNA 表达最高,100 pg/mL 的 β-葡聚糖刺激OREs 8 h时SBD-1蛋白表达达到峰值,而分别用50和200 μg/mL刺激OREs 12 h时IL-6和IL-10蛋白表达达到最大。本研究结果表明β-葡聚糖能够提高ORECs内SBD-1的表达,且该过程由Dectin-1-Syk/TLR-2-MyD88-MAPK/NF-κB信号通路共同介导产生,但可能主要通过Dectin-1-Syk/TLR-2-MyD88-NF-κB信号通路。此外,本研究还确定了 OREs体外培养的可行性和最佳条件,并证明β-葡聚糖可以激活OREs中SBD-1、IL-6和IL-10的分泌。
二、The Expression of Toll-like Receptor 2 and 4 mRNA in Local Tissues of Model of Oropharyngeal Candidiasis in Mice（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、The Expression of Toll-like Receptor 2 and 4 mRNA in Local Tissues of Model of Oropharyngeal Candidiasis in Mice（论文提纲范文）
（1）昆断益母方调控Treg/Th17细胞失衡和抗类风湿关节炎的机制研究（论文提纲范文）
| 答辩委员会名单及评定意见 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1.1 类风湿关节炎研究概况 |
| 1.2 中医药治疗类风湿关节炎研究概况 |
| 1.3 TH17/TREG细胞平衡与类风湿关节炎的研究进展 |
| 1.4 研究目的 |
| 第二章 实验研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验细胞 |
| 2.1.3 主要实验试剂和耗材 |
| 2.1.4 主要实验仪器和设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 药物的准备和保存 |
| 2.2.2 CIA模型制备 |
| 2.2.3 动物实验分组及处理方法 |
| 2.2.4 小鼠踝关节HE染色 |
| 2.2.5 血清和PBMC细胞分离 |
| 2.2.6 组织RNA提取 |
| 2.2.7 细胞总RNA提取与定量 |
| 2.2.8 cDNA第一链合成 |
| 2.2.9 荧光定量PCR |
| 2.2.10 ELISA法检测细胞因子 |
| 2.2.11 细胞培养与传代 |
| 2.2.12 细胞的冻存与复苏 |
| 2.2.13 CD~(4+)T细胞磁珠分选及培养 |
| 2.2.14 细胞实验分组与药物干预 |
| 2.2.15 流式细胞术 |
| 2.2.16 细胞实验分组与药物干预 |
| 2.2.17 CCK8法检测细胞增殖 |
| 2.2.18 Transwell检测细胞迁移能力 |
| 2.2.19 Transwell检测细胞侵袭能力 |
| 2.2.20 数据统计处理 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 CIA小鼠关节指数评分 |
| 3.2 CIA小鼠踝关节组织HE染色 |
| 3.3 昆断益母方对CIA小鼠在免疫的第35天时PBMC中Foxp3和RORγt mRNA表达水平的影响 |
| 3.4 昆断益母方对CIA小鼠在免疫的第35天时关节滑膜组织中Foxp3和RORγt mRNA表达水平的影响 |
| 3.5 昆断益母方对CIA小鼠在免疫的第35天时PBMC中IL-1β、IL-17、TNF-α、IL-10表达水平的影响 |
| 3.6 昆断益母方对CIA小鼠在免疫的第35天时血清中MIR-21-5P表达水平的影响 |
| 3.7 昆断益母方对CIA小鼠在免疫的第35天时关节滑膜组织中MIR-21-5P表达水平的影响 |
| 3.8 昆断益母方对CIA小鼠在免疫的第35天时血清中TLR4和STAT3 mRNA表达水平的影响 |
| 3.9 昆断益母方对CIA小鼠在免疫的第35天时关节滑膜组织中TLR4和STAT3 mRNA表达水平的影响 |
| 3.10 昆断益母方对CIA小鼠在免疫的第35天时关节软骨组织中TLR4和STAT3 mRNA表达水平的影响 |
| 3.11 昆断益母方对初始T细胞中炎症因子IL-17、IL-1β、TNF-α和IL-10 mRNA表达水平的影响 |
| 3.12 昆断益母方对初始T细胞分化的TH17细胞和TREG细胞比例的影响 |
| 3.13 昆断益母方对初始T细胞与滑膜细胞共培养后细胞的增殖的影响 |
| 3.14 昆断益母方对初始T细胞与滑膜细胞共培养后细胞迁移和侵袭的影响 |
| 3.15 昆断益母方对初始T细胞与滑膜细胞共培养后细胞中MIR-21-5P表达的影响 |
| 3.16 昆断益母方对初始T细胞与滑膜细胞共培养后细胞中Foxp3和RORγt mRNA表达的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 昆断益母方能改善CIA小鼠类风湿性关节炎症状 |
| 4.2 昆断益母方能改善CIA小鼠体内TREG/TH17细胞比例 |
| 4.3 昆断益母方能改善CIA小鼠体内炎症因子表达水平 |
| 4.4 昆断益母方能上调CIA小鼠体内MIR-21-5P表达水平 |
| 4.5 昆断益母方能降低CIA小鼠体内TLR4和STAT3表达水平 |
| 4.6 昆断益母方能抑制FLS细胞的迁移和侵袭 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
（2）TSLP及cGAS-STING调控角膜抗真菌感染免疫反应的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 烟曲霉菌刺激DCs分泌TSLP诱导Th17型炎症反应研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 主要材料试剂与仪器设备 |
| 3 实验方法 |
| 4. 实验结果 |
| 5. 讨论 |
| 6. 结论 |
| 第二部分 TSLP通过JAKfSTAT信号通路诱导Th17炎症反应机制研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 主要材料试剂与仪器设备 |
| 3. 实验方法 |
| 4. 实验结果 |
| 5. 讨论 |
| 6. 结论 |
| 第三章 cGAS-STING通路促进真菌性角膜炎免疫炎症反应机制研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 主要材料试剂与仪器设备 |
| 3. 实验方法 |
| 4. 实验结果 |
| 5. 讨论 |
| 6. 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表的主要学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文1 |
| 外文论文2 |
（3）TRIM26通过调控Th17细胞分化发挥抗真菌作用的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 实验结果 |
| 1. TRIM26敲除小鼠对白色念珠菌抵抗力更低 |
| 2. TRIM26敲除小鼠清除白色念珠菌能力降低 |
| 3. TRIM26不影响免疫细胞的发育 |
| 4. TRIM26不依赖固有免疫细胞的吞噬杀伤清除真菌 |
| 5. TRIM26不通过CLR通路影响细胞因子的表达 |
| 6. TRIM26敲除小鼠感染白色念珠菌后组织内中性粒细胞募集增多 |
| 7. TRIM26缺失增强了小鼠感染白色念珠菌后Th17细胞反应 |
| 8. TRIM26敲除小鼠感染白色念珠菌后造成更严重的肾脏损伤 |
| 9. TRIM26调控抗真菌免疫的模式图 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 原始数据 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（4）白色念珠菌通过激活炎症信号途径在小鼠模型中诱导急性肺损伤的研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 支气管肺白色念珠菌小鼠感染模型和免疫抑制小鼠模型的建立和评价 |
| 1.前言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 主要试剂来源 |
| 2.2 主要试剂配制 |
| 2.3 主要仪器 |
| 2.4 主要实验方法和技术 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 实验小鼠的一般情况 |
| 3.2 小鼠的脾脏重量指数 |
| 3.3 小鼠外周血流式细胞术结果 |
| 3.4 白色念珠菌感染模型小鼠肺部病理PAS染色及肺组织培养 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 白色念珠菌诱导小鼠急性肺损伤的炎症信号机制的探讨 |
| 1.前言 |
| 2.材料和方法 |
| 2.1 主要试剂来源 |
| 2.2 主要试剂配制 |
| 2.3 主要仪器 |
| 2.4 主要实验方法和技术 |
| 3.结果 |
| 3.1 白色念珠菌感染致正常和免疫抑制小鼠急性肺损伤 |
| 3.2 白色念珠菌感染上调正常和免疫抑制小鼠肺部炎症因子和趋化因子的表达 |
| 3.3 白色念珠菌感染激活小鼠肺中NF-κB信号 |
| 3.4 白色念珠菌感染激活小鼠肺中MAPKs信号 |
| 3.5 白色念珠菌感染激活小鼠肺中PI3K/Akt信号 |
| 3.6 白色念珠菌感染激活小鼠的肺STAT3 信号 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 白色念珠菌相关毒力因子的研究进展 |
| 参考文献 |
（5）白头翁汤正丁醇提取物改善VVC小鼠阴道黏膜屏障及主要组分小檗碱抑制白念珠菌黏附阴道上皮的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词 |
| 前言 |
| 第一部分 白头翁汤正丁醇提取物对外阴阴道念珠菌病小鼠阴道黏膜上皮屏障的影响 |
| 1 实验材料和仪器 |
| 1.1 实验菌株与药物 |
| 1.2 动物 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 主要溶液配制 |
| 1.5 仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 菌液配制 |
| 2.2 小鼠VVC模型的构建 |
| 2.3 药物治疗 |
| 2.4 小鼠阴道局部症状体征及活动状态观察 |
| 2.5 小鼠阴道涂片镜检(观察小鼠阴道分泌物中白念珠菌形态) |
| 2.6 小鼠阴道灌洗液真菌载荷计数 ( 平板法计数小鼠阴道灌洗液真菌载荷量) |
| 2.7 小鼠阴道黏膜组织病理学检测 |
| 2.8 组织学观察(HE染色、PAS染色、MT染色)VVC小鼠阴道黏膜上皮的完整性 |
| 2.9 免疫组化检测小鼠阴道黏膜上皮细胞黏蛋白(Mucin1、Mucin4)及β-防御素2 蛋白的表达 |
| 2.10 Westernblot法检测小鼠阴道黏膜上皮黏蛋白(Mucin1、Mucin4)及β-防御素2 蛋白水平 |
| 2.11 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 动物整体状态及阴道局部体征 |
| 3.2 BAEB对 VVC小鼠阴道分泌物中白念珠菌形态的影响 |
| 3.3 BAEB对 VVC小鼠阴道真菌载荷的影响 |
| 3.4 BAEB对 VVC小鼠阴道黏膜组织病变的影响 |
| 3.5 BAEB对 VVC小鼠阴道黏膜上皮完整性的影响 |
| 3.6 BAEB对 VVC小鼠阴道黏膜上皮细胞黏蛋白mucin1、mucin4及β-防御素2 表达的影响 |
| 3.7 BAEB对 VVC小鼠阴道黏膜上皮mucin1、mucin4和β-防御素2 蛋白水平的影响 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 白头翁汤正丁醇提取物主要组分盐酸小檗碱对白念珠菌黏附阴道上皮细胞的影响 |
| 1 实验材料和仪器 |
| 1.1 细胞 |
| 1.2 实验菌株与药物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要试剂与药物(母液)处理 |
| 1.5 实验仪器与实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养(复苏、换液、传代及冻存) |
| 2.2 A431 细胞浓度确定 |
| 2.3 不同时间段盐酸小檗碱最佳浓度确定与形态学观察 |
| 2.4 不同浓度的白念珠菌于不同时间对 A431 细胞黏附的影响 |
| 2.5 细胞分组 |
| 2.6 盐酸小檗碱对白念珠菌在不同时间黏附A431 细胞的影响 |
| 2.7 ELISA法检测盐酸小檗碱对白念珠菌在不同时间段刺激下A431 细胞分泌IL-2、IL-4 水平的影响 |
| 2.8 免疫荧光检测不同时间点 A431 细胞 ICAM-1 表达 |
| 2.9 Western blot 检测盐酸小檗碱干预白念珠菌不同时间点刺激下A431 细胞 ICAM-1、mucin-1、mucin-4 蛋白表达 |
| 2.10 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 A431 细胞最适浓度的确定 |
| 3.2 不同时间段盐酸小檗碱安全浓度的确定 |
| 3.3 盐酸小檗碱对细胞生长状态的影响 |
| 3.4 不同浓度的白念珠菌于不同时间对A431 细胞的黏附 |
| 3.5 盐酸小檗碱对白念珠菌在不同时间黏附A431 细胞的影响 |
| 3.6 盐酸小檗碱对A431 细胞在白念珠菌不同时间刺激下分泌IL-2、IL-4 水平的影响 |
| 3.7 盐酸小檗碱对A431 细胞在白念珠菌不同时间刺激下IL-2/IL-4比例的影响 |
| 3.8 盐酸小檗碱对A431 细胞在白念珠菌不同时间的刺激下黏附分子ICAM-1 表达的影响 |
| 3.9 盐酸小檗碱对A431 细胞在白念珠菌不同时间的刺激下ICAM-1、mucin-1、mucin-4 蛋白水平的影响 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 阴道黏膜屏障在抗感染中的作用 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（6）雌二醇调控绵羊输卵管黏膜上皮细胞S100A8和A9表达的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 输卵管黏膜功能及受雌激素调控的相关分子机制 |
| 1.1.1 雌激素的作用通路 |
| 1.1.2 输卵管黏膜与配子运输及雌激素的调控 |
| 1.1.3 输卵管黏膜与受精及雌激素的调控 |
| 1.1.4 输卵管黏膜与胚胎发育及雌激素的调控 |
| 1.1.5 输卵管黏膜免疫及雌激素的调控 |
| 1.1.6 输卵管黏膜免疫功能失调及雌激素的作用 |
| 1.2 S100A8和S100A9参与天然免疫 |
| 1.2.1 S100A8和S100A9基因及其基因产物 |
| 1.2.2 S100A8和S100A9的表达调控 |
| 1.2.3 S100A8和S100A9参与肿瘤免疫 |
| 1.2.4 S100A8和S100A9参与抗感染作用 |
| 1.2.5 S100A8/S100A9参与炎症调节和损伤修复 |
| 1.2.6 生殖系统中的S100A8和S100A9 |
| 1.3 本研究的目的和意义 |
| 2 实验一 雌激素影响绵羊输卵管上皮细胞的转录组学分析 |
| 2.1 材料、试剂与设备 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验设备、器材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞原代培养 |
| 2.2.2 通过检测CK18鉴定上皮细胞 |
| 2.2.3 用于测序细胞材料的处理 |
| 2.2.4 RNA的提取 |
| 2.2.5 转录组测序 |
| 2.2.6 基因表达水平统计、差异基因分析及功能富集分析 |
| 2.2.7 q-PCR验证及相关性分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 原代培养的输卵管黏膜上皮细胞 |
| 2.3.2 上皮细胞的鉴定 |
| 2.3.3 RNA-seq测序质量 |
| 2.3.4 基因表达数目和基因表达值分布统计 |
| 2.3.5 基因差异表达分析及功能富集性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 3 实验二 S100A8和S100A9的输卵管组织分布及其受E2的调控 |
| 3.1 实验材料、试剂及设备 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 免疫组织化学法检测绵羊输卵管组织中S100A8、S100A9的表达 |
| 3.2.2 q-PCR检测不同时间和不同浓度E2作用下S100A8、S100A9mRNA表达 |
| 3.2.3 WB检测在最适浓度和时间E2作用下S100A8、S100A9蛋白表达 |
| 3.2.4 统计学方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 S100A8及S100A9在绵羊输卵管组织的表达及分布 |
| 3.3.2 E2在不同浓度和不同时间下对S100A8及S100A9 mRNA表达的影响 |
| 3.3.3 E2在最适浓度和时间下对S100A8、S100A9蛋白表达的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 4 实验三 E2通过雌激素受体调控S100A8、S100A9的表达 |
| 4.1 实验材料、试剂和设备 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 雌激素受体抑制剂浓度筛选 |
| 4.2.2 q-PCR检测三种雌激素受体抑制剂作用下S100A8、S100A9的表4.2.3 WB检测三种雌激素受体抑制剂作用下S100A8、S100A9的表达 |
| 4.2.3 WB检测三种雌激素受体抑制剂作用下S100A8、S100A9的表达 |
| 4.2.4 统计学方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 雌激素抑制剂有效浓度 |
| 4.3.2 三种雌激素受体抑制剂对S100A8、S100A9 mRNA表达的影响 |
| 4.3.3 三种雌激素受体抑制剂对S100A8、S100A9蛋白表达的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 5 实验四 E2通过JNK-MAPK信号通路调控S100A8的表达 |
| 5.1 实验材料、试剂及设备 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验试剂 |
| 5.1.3 实验设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 q-PCR检测三种MAPK抑制剂作用下S100A8的表达 |
| 5.2.2 WB检测三种MAPK抑制剂作用下S100A8的表达 |
| 5.2.3 WB检测雌激素受体抑制剂对p-JNK/JNK的影响 |
| 5.2.4 统计学方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 三种MAPK抑制剂对S100A8 mRNA表达的影响 |
| 5.3.2 三种MAPK抑制剂对S100A8蛋白表达的影响 |
| 5.3.3 雌激素受体对输卵管上皮细胞p-JNK/JNK的激活 |
| 5.4 讨论 |
| 6 实验五输卵管黏膜上皮细胞S100A8基因敲低 |
| 6.1 实验材料、试剂及设备 |
| 6.1.1 实验材料 |
| 6.1.2 实验试剂 |
| 6.1.3 实验设备 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 CRISPR/Cas9 S100A8敲除载体的构建 |
| 6.2.2 质粒的提取 |
| 6.2.3 S100A8敲除质粒转染输卵管上皮细胞 |
| 6.2.4 q-PCR检测S100A8的敲除效率 |
| 6.2.5 WB检测S100A8的敲除效率 |
| 6.2.6 ELISA检测S100A8敲除后细胞中免疫因子的变化情况 |
| 6.2.7 统计学方法 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 质粒的转染效率 |
| 6.3.2 S100A8 mRNA的敲低 |
| 6.3.3 S100A8蛋白的敲低 |
| 6.3.4 S100A8敲低后细胞中免疫因子的变化 |
| 6.4 讨论 |
| 7 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（7）一株分离自慢性复发性颈部淋巴结炎患者的白念珠菌的微生物学特征及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1 白念珠菌概述 |
| 2 白念珠菌的形态转换 |
| 2.1 形态转换概述 |
| 2.2 形态转换环境刺激因子 |
| 2.3 菌丝发育的转录调控机制 |
| 3 白念珠菌致病机制 |
| 3.1 黏附因子 |
| 3.2 形态转换能力 |
| 3.3 侵入生长能力 |
| 3.4 生物膜形成能力 |
| 3.5 对宿主环境的适应能力 |
| 4 白念珠菌感染的临床基础研究进展 |
| 4.1 概述 |
| 4.2 粘膜感染 |
| 4.3 侵袭性念珠菌病 |
| 5 白念珠菌病治疗药物的进展 |
| 5.1 药物种类 |
| 5.2 作用机制 |
| 5.3 耐药机制 |
| 6 白念珠菌与宿主的相互作用 |
| 6.1 宿主对念珠菌的识别及清除 |
| 6.2 念珠菌的宿主防御机制 |
| 7 研究内容、思路和方法 |
| 7.1 研究内容 |
| 7.2 研究思路 |
| 7.3 本研究的理论意义和应用价值 |
| 第二章 JL01 的形态学及分子生物学鉴定 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 菌株 |
| 2.2 常用试剂 |
| 2.3 主要仪器 |
| 2.4 配制培养基 |
| 2.5 配制常用缓冲液和其它溶液 |
| 2.6 引物 |
| 2.7 DNA提取方法 |
| 2.8 DNA 核酸纯度与浓度测定 |
| 2.9 rDNA-ITS 扩增 |
| 2.10 测序与分析 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 JL01 体外培养的形态学观察及初步分子机制研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 菌株 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器 |
| 2.4 配制培养基 |
| 2.5 白念珠菌形态学培养 |
| 2.6 白念珠菌侵入生长试验 |
| 2.7 白念珠菌包埋形态观察 |
| 2.8 白念珠菌生长曲线 |
| 2.9 白念珠菌RNA抽提(热酚法) |
| 2.10 反转录cDNA方法 |
| 2.11 qRT-PCR实验方法 |
| 2.12 数据收集及分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 不同液体培养基对JL01 菌丝发育的影响 |
| 3.2 不同固体培养基对JL01 菌落形态的影响 |
| 3.3 包埋形态 |
| 3.4 侵入生长试验 |
| 3.5 生长曲线 |
| 3.6 菌丝特异性基因的表达差异 |
| 4 讨论 |
| 第四章 JL01 对外界环境压力的敏感性测试 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 菌株及培养条件 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器 |
| 2.4 不同试剂应激反应实验方法 |
| 2.5 透射电镜样品制备步骤 |
| 2.7 qRT-PCR 实验方法及数据分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 JL01 对唑类药物的敏感性结果 |
| 3.2 JL01 对细胞壁破坏试剂的敏感性结果 |
| 3.3 JL01 对氧化应激及高渗透压力的敏感性结果 |
| 3.4 JL01 对DNA损伤试剂及不同代谢压力的敏感性结果 |
| 3.5 JL01 中抗氧化应激和高渗透压力相关基因的表达差异 |
| 3.6 JL01 中耐药相关基因的表达差异 |
| 3.7 JL01 和SC5314 的细胞壁结构差异 |
| 4 讨论 |
| 第五章 JL01 致系统性感染小鼠模型及肠道感染模型的构建 |
| 第一节 JL01 和SC5314 毒力、真菌负荷及病理的比较 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试剂与仪器 |
| 2.2 接种菌液的准备 |
| 2.3 绘制小鼠生存曲线 |
| 2.4 小鼠不同组织器官真菌负荷计算 |
| 2.5 小鼠肾脏组织病理检查 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 生存曲线 |
| 3.2 小鼠不同组织器官真菌负荷 |
| 3.3 肾组织病理 |
| 4 讨论 |
| 第二节 系统性感染小鼠模型中免疫系统应答的比较 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 小鼠系统性感染模型 |
| 2.2 提RNA |
| 2.3 反转cDNA及 qRT-PCR |
| 2.4 白念珠菌与BMDM共培养 |
| 2.5 qRT-PCR 实验方法 |
| 2.6 数据处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 感染小鼠肾脏组织中细胞因子的表达量差异 |
| 3.2 白念珠菌与BMDM共培养形态观察 |
| 3.3 JL01 中免疫逃逸相关基因的表达差异 |
| 4 讨论 |
| 第三节 JL01 和SC5314 构建小鼠肠道感染模型的比较 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 小鼠肠道感染模型定植情况 |
| 3.2 肠道感染后小鼠体重变化情况 |
| 4 讨论 |
| 第六章 JL01 压力应激,形态异常及免疫逃逸相关分子机制的初步研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.0 试剂与仪器 |
| 2.1 样品准备 |
| 2.2 小鼠生存曲线 |
| 2.3 RNA 提取 |
| 2.4 Oligo d T 富集 mRNA |
| 2.5 片段化 mRNA |
| 2.6 反转合成 cDNA |
| 2.7 连接 adaptor |
| 2.8 Illumina Hiseq 上机测序 |
| 2.9 数据分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 RNA-seq分析结果概况 |
| 3.2 JL01 中逃避或耐受宿主免疫应答相关基因的表达变化 |
| 3.3 JL01 中抗氧化应激和抗高渗透压力相关基因的表达变化 |
| 3.4 JL01 中菌丝发育和侵入生长相关基因的表达变化 |
| 4 讨论 |
| 第七章 总结与展望 |
| 1 全文总结 |
| 2 论文的创新点 |
| 3 论文的待改进之处 |
| 综述:白念珠菌的免疫逃逸机制 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 英文参考文献 |
| 中文参考文献 |
| 已发表论文 |
| 致谢 |
（8）银屑灵调节朗格汉斯细胞和T helper细胞的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1.1 银屑病的研究概况 |
| 1.1.1 树突状细胞与银屑病 |
| 1.1.2 T细胞与银屑病 |
| 1.2 银屑病的治疗进展 |
| 1.2.1 传统药物治疗 |
| 1.2.2 生物制剂 |
| 1.3 中医对银屑病的认识 |
| 1.3.1 从中医药角度认识银屑病 |
| 1.3.2 银屑灵的研究概况 |
| 1.4 技术路线图 |
| 第二章 银屑灵对LC的调节作用及机制研究 |
| 2.1 银屑灵治疗银屑病药效研究 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.3 实验结果 |
| 2.1.4 讨论 |
| 2.1.5 结论 |
| 2.2 银屑灵对LC的调节作用研究 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.3 实验结果 |
| 2.2.4 讨论 |
| 2.2.5 小结 |
| 2.3 银屑灵对Th细胞的调控作用 |
| 2.3.1 实验材料 |
| 2.3.2 实验方法 |
| 2.3.3 实验结果 |
| 2.3.4 讨论 |
| 2.3.5 小结 |
| 第三章 银屑灵主要有效成分花旗松素治疗银屑病的作用及机制研究 |
| 3.1 花旗松素对银屑病药效评价及机制研究 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.3 实验结果 |
| 3.1.4 讨论 |
| 3.1.5 小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
（9）C型产气荚膜梭菌性腹泻仔猪脾脏lncRNA、mRNA和miRNA测序及功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 仔猪腹泻的危害及主要原因 |
| 2 产气荚膜梭菌简介 |
| 2.1 产气荚膜梭菌的毒素种类及其分型 |
| 2.2 C型产气荚膜梭菌 |
| 2.3 C型产气荚膜梭菌的致病机理 |
| 3 脾脏在产气荚膜梭菌性疾病中的作用 |
| 4 LncRNA测序概述 |
| 4.1 LncRNA简介 |
| 4.2 LncRNA的来源 |
| 4.3 LncRNA的分类 |
| 4.4 LncRNA的作用方式 |
| 4.5 LncRNA参与的生物学过程 |
| 4.6 LncRNA在宿主抵抗感染性疾病中的研究进展 |
| 5 mRNA在宿主抵抗感染性疾病中的研究进展 |
| 6 miRNA测序概述 |
| 6.1 miRNA简介 |
| 6.2 miRNA的特征 |
| 6.3 miRNA的转录和加工 |
| 6.3.1 miRNA的转录 |
| 6.3.2 miRNA的加工 |
| 6.4 miRNA的作用方式 |
| 6.5 miRNA在宿主抵抗感染性疾病中的研究进展 |
| 7 本研究选题背景、研究内容及目的意义 |
| 7.1 选题背景 |
| 7.2 研究内容 |
| 7.3 目的意义 |
| 第二章 脾脏lncRNA和 mRNA测序及功能分析 |
| 1 试验材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 实验仪器设备与试剂 |
| 1.2.1 主要仪器设备 |
| 1.2.2 主要试剂 |
| 1.2.3 主要溶液配制 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 C型产气荚膜梭菌培养 |
| 2.2 仔猪攻毒试验 |
| 2.3 样品采集 |
| 2.4 总RNA提取 |
| 2.5 总RNA质量与浓度检测 |
| 2.5.1 琼脂糖凝胶电泳检测 |
| 2.5.2 核酸蛋白检测仪检测 |
| 2.5.3 毛细管电泳检测 |
| 2.6 LncRNA文库构建及测序 |
| 2.6.1 LncRNA文库构建 |
| 2.6.2 LncRNA文库测序 |
| 2.7 LncRNA测序数据处理及生物信息学分析 |
| 2.7.1 LncRNA测序数据质量检测 |
| 2.7.2 基因组比对 |
| 2.7.3 转录本拼接 |
| 2.7.4 已知mRNA鉴定 |
| 2.7.5 LncRNA鉴定 |
| 2.7.6 新mRNA鉴定和可变剪切分析 |
| 2.7.7 LncRNA和 mRNA表达水平分析 |
| 2.7.8 LncRNA基因组特征分析 |
| 2.7.9 LncRNA靶基因预测 |
| 2.7.10 GO功能和KEGG信号通路富集分析 |
| 2.7.11 LncRNA二级结构预测 |
| 2.7.12 腹泻抗性相关lncRNA筛选 |
| 2.8 RT-qPCR实验 |
| 2.8.1 测序结果的RT-qPCR验证 |
| 2.8.2 腹泻抗性相关lncRNA靶基因信号通路关键基因表达量检测 |
| 2.8.3 LncRNA组织表达谱构建 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 LncRNA文库构建及测序数据处理结果 |
| 3.1.1 总RNA提取及质量检测结果 |
| 3.1.2 测序数据概述 |
| 3.1.3 测序错误率结果 |
| 3.1.4 基因组比对结果 |
| 3.1.5 样品间相关性分析结果 |
| 3.2 LncRNA筛选及其基因组特征分析结果 |
| 3.2.1 LncRNA筛选结果 |
| 3.2.2 LncRNA基因组特征分析结果 |
| 3.3 LncRNA和 mRNA差异表达分析结果 |
| 3.3.1 差异表达lncRNA和 mRNA数量统计结果 |
| 3.3.2 差异表达lncRNA和 mRNA聚类结果 |
| 3.3.3 差异表达lncRNA和 mRNA染色体分布结果 |
| 3.4 差异表达lncRNA和 mRNA功能分析结果 |
| 3.4.1 差异表达lncRNA功能分析结果 |
| 3.4.2 差异表达mRNA功能分析结果 |
| 3.5 腹泻抗性相关lncRNA筛选结果 |
| 3.5.1 潜在腹泻抗性相关lncRNA信息 |
| 3.5.2 潜在腹泻抗性相关lncRNA二级结构的预测结果 |
| 3.5.3 腹泻抗性相关lncRNA的逐步筛选结果 |
| 3.6 测序结果的RT-qPCR验证结果 |
| 3.7 腹泻抗性相关lncRNA靶基因信号通路关键基因表达量检测结果 |
| 3.8 LncRNA组织表达谱结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 测序质量评估 |
| 4.2 LncRNA筛选及其基因组特征 |
| 4.3 LncRNA组织表达谱 |
| 4.4 LncRNA二级结构 |
| 4.5 脾脏组织lncRNA和 mRNA功能富集 |
| 4.6 C型产气荚膜梭菌性腹泻抗性相关lncRNA |
| 5 小结 |
| 第三章 脾脏miRNA测序及功能分析 |
| 1 试验材料 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 C型产气荚膜梭菌培养 |
| 2.2 仔猪攻毒试验 |
| 2.3 样品采集 |
| 2.4 总RNA提取 |
| 2.5 总RNA质量与浓度检测 |
| 2.6 miRNA文库构建及测序 |
| 2.6.1 miRNA文库构建 |
| 2.6.2 miRNA文库测序 |
| 2.7 miRNA测序数据处理及生物信息学分析 |
| 2.7.1 测序数据的质量检测 |
| 2.7.2 参考序列比对获取已知miRNA和新miRNA |
| 2.7.3 small RNA分类注释 |
| 2.7.4 miRNA家族分析 |
| 2.7.5 miRNA表达水平及差异分析 |
| 2.7.6 miRNA靶基因预测 |
| 2.7.7 miRNA靶基因GO功能和KEGG信号通路富集分析 |
| 2.7.8 腹泻抗性相关miRNA筛选 |
| 2.8 miRNA的 RT-qPCR验证及靶基因表达量检测 |
| 2.8.1 miRNA的 RT-qPCR验证 |
| 2.8.2 miRNA靶基因表达量检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 测序数据质量控制及长度分析结果 |
| 3.1.1 测序数据质量控制结果 |
| 3.1.2 small RNA长度分析结果 |
| 3.2 small RNA基因组定位及分类注释结果 |
| 3.2.1 small RNA基因组定位结果 |
| 3.2.2 small RNA分类注释结果 |
| 3.3 已知miRNA和新miRNA首位碱基及各位碱基偏好性分布结果 |
| 3.4 miRNA家族分析结果 |
| 3.5 miRNA差异表达分析结果 |
| 3.5.1 miRNA表达水平分析结果 |
| 3.5.2 样品间相关性分析结果 |
| 3.5.3 差异表达miRNA统计结果 |
| 3.5.4 差异表达miRNA聚类结果 |
| 3.6 miRNA靶基因预测及富集分析结果 |
| 3.6.1 miRNA靶基因预测结果 |
| 3.6.2 miRNA靶基因GO功能富集分析结果 |
| 3.6.3 miRNA靶基因KEGG信号通路富集分析结果 |
| 3.7 腹泻抗性相关miRNA筛选结果 |
| 3.7.1 潜在腹泻抗性相关miRNA的信息结果 |
| 3.7.2 腹泻抗性相关miRNA的逐步筛选结果 |
| 3.8 miRNA的 RT-qPCR验证及其靶基因表达量检测结果 |
| 3.8.1 miRNA的 RT-qPCR验证结果 |
| 3.8.2 miRNA靶基因表达量检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 测序数据质控及small RNA长度 |
| 4.2 猪脾脏miRNA |
| 4.3 猪脾脏miRNA靶基因预测 |
| 4.4 脾脏组织miRNA功能富集 |
| 4.5 C型产气荚膜梭菌性腹泻抗性相关miRNA |
| 5 小结 |
| 第四章 全文结论 |
| 第五章 创新点及展望 |
| 1 创新点 |
| 2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（10）酿酒酵母β-葡聚糖对绵羊瘤胃上皮细胞和外植体内β-防御素-1表达影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 抗微生物肽 |
| 1.1.1 抗微生物肽简介 |
| 1.1.2 抗微生物肽分类 |
| 1.1.3 抗微生物肽作用机制 |
| 1.2 防御素 |
| 1.2.1 防御素简介及其分类 |
| 1.3 β-防御素 |
| 1.3.1 β-防御素的结构与分布 |
| 1.3.2 β-防御素的生物学活性 |
| 1.4 益生菌 |
| 1.4.1 益生菌简介 |
| 1.4.2 益生菌诱导抗微生物肽的分泌 |
| 1.5 酿酒酵母菌 |
| 1.5.1 酿酒酵母菌简介 |
| 1.5.2 酿酒酵母菌的作用 |
| 1.5.3 酿酒酵母菌的细胞壁成分 |
| 1.6 β-葡聚糖 |
| 1.6.1 β-葡聚糖的结构 |
| 1.6.2 β-葡聚糖的生物活性 |
| 1.7 识别真菌的模式识别受体 |
| 1.8 识别β-葡聚糖的受体 |
| 1.8.1 Dectin-1受体 |
| 1.8.2 TLR-2受体 |
| 1.9 NF-κB信号通路 |
| 1.9.1 经典NF-κB信号通路 |
| 1.9.2 非经典NF-κB信号通路 |
| 1.10 MAPK信号通路 |
| 1.10.1 JNK和p38 MAPK信号通路 |
| 1.10.2 ERK信号通路 |
| 1.11 研究目的及意义 |
| 1.12 研究内容 |
| 1.12.1 β-葡聚糖刺激ORECs对SBD-1表达的影响 |
| 1.12.2 β-葡聚糖诱导ORECs SBD-1表达的信号通路研究 |
| 1.12.3 OREs培养体系的建立 |
| 1.12.4 β-葡聚糖对OREs内免疫因子的影响 |
| 2 试验一 β-葡聚糖刺激ORECs对SBD-1表达的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.2 试验结果 |
| 2.2.1 ORECs培养结果 |
| 2.2.2 β -actin和SBD-1基因qPCR扩增产物特异性检测结果 |
| 2.2.3 β -actin和SBD-1基因qPCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析结果 |
| 2.2.4 β-葡聚糖刺激ORECs对SBD-1 mRNA表达的影响 |
| 2.2.5 β-葡聚糖刺激ORECs对SBD-1蛋白表达的影响 |
| 2.2.6 β-葡聚糖刺激ORECs对上皮细胞活力影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 3 试验二 β-葡聚糖诱导ORECs SBD-1表达的信号通路研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.2 试验结果 |
| 3.2.1 Dectin-1在ORECs中的表达检测结果 |
| 3.2.2 β-葡聚糖刺激ORECs后对Dectin-1表达的影响 |
| 3.2.3 β-葡聚糖诱导SBD-1表达过程中Dectin-1的作用 |
| 3.2.4 Syk在ORECs中的表达检测结果 |
| 3.2.5 β-葡聚糖刺激ORECs后对Syk磷酸化水平的影响 |
| 3.2.6 β -葡聚糖诱导SBD-1表达过程中Syk的作用 |
| 3.2.7 β-葡聚糖通过Dectin-1激活Syk |
| 3.2.8 β-葡聚糖刺激ORECs对TLR-2表达的影响 |
| 3.2.9 β-葡聚糖诱导SBD-1表达过程中TLR-2的作用 |
| 3.2.10 β-葡聚糖诱导SBD-1表达过程中MyD88的作用 |
| 3.2.11 β-葡聚糖通过TLR-2激活MyD88 |
| 3.2.12 β-葡聚糖刺激ORECs对p38、JNK、ERK1/2和NF-κ B表达的影响 |
| 3.2.13 抑制p38、JNK、ERK1/2和NF-κ B后对β-葡聚糖诱导SBD-1表达的影响 |
| 3.2.14 β-葡聚糖刺激ORECs后对NF-κ B信号通路的影响 |
| 3.2.15 β-葡聚糖通过Syk和MyD88激活NF-κ B信号通路 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 4 试验三 OREs培养体系的建立 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验方法 |
| 4.2 试验结果 |
| 4.2.1 OREs培养基的筛选 |
| 4.2.2 OREs培养时间的筛选 |
| 4.2.3 培养的OREs活性检测 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 5 试验四 β-葡聚糖对OREs内免疫因子的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 试验方法 |
| 5.2 试验结果 |
| 5.2.1 β-actin、SBD-1、IL-6和IL-10基因qPCR扩增产物特异性检测结果 |
| 5.2.2 β -actin、SBD-1、IL-6和IL-10基因qPCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳分析结果 |
| 5.2.3 β-葡聚糖刺激OREs对SBD-1、IL-6和IL-10 mRNA表达的影响 |
| 5.2.4 β-葡聚糖刺激OREs对SBD-1、IL-6和IL-10蛋白表达的影响 |
| 5.2.5 β-葡聚糖刺激OREs对其活性影响 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 6 结论 |
| 7 创新性 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
四、The Expression of Toll-like Receptor 2 and 4 mRNA in Local Tissues of Model of Oropharyngeal Candidiasis in Mice（论文参考文献）
- [1]昆断益母方调控Treg/Th17细胞失衡和抗类风湿关节炎的机制研究[D]. 范氏绒. 广州中医药大学, 2021
- [2]TSLP及cGAS-STING调控角膜抗真菌感染免疫反应的作用及机制研究[D]. 韩芳. 山东大学, 2021(11)
- [3]TRIM26通过调控Th17细胞分化发挥抗真菌作用的机制研究[D]. 李艳琦. 山东大学, 2021(12)
- [4]白色念珠菌通过激活炎症信号途径在小鼠模型中诱导急性肺损伤的研究[D]. 许知礼. 安徽医科大学, 2021(01)
- [5]白头翁汤正丁醇提取物改善VVC小鼠阴道黏膜屏障及主要组分小檗碱抑制白念珠菌黏附阴道上皮的作用研究[D]. 赵婷. 安徽中医药大学, 2021(01)
- [6]雌二醇调控绵羊输卵管黏膜上皮细胞S100A8和A9表达的机制研究[D]. 李晓丹. 内蒙古农业大学, 2020
- [7]一株分离自慢性复发性颈部淋巴结炎患者的白念珠菌的微生物学特征及其机制研究[D]. 张成臻. 南京大学, 2020(09)
- [8]银屑灵调节朗格汉斯细胞和T helper细胞的作用及机制研究[D]. 李宁. 广州中医药大学, 2020(06)
- [9]C型产气荚膜梭菌性腹泻仔猪脾脏lncRNA、mRNA和miRNA测序及功能分析[D]. 闫尊强. 甘肃农业大学, 2019
- [10]酿酒酵母β-葡聚糖对绵羊瘤胃上皮细胞和外植体内β-防御素-1表达影响的研究[D]. 张曼. 内蒙古农业大学, 2019(01)