霍乱弧菌tcpA基因的克隆表达及其免疫保护作用研究

论文摘要

霍乱弧菌（Vibrio cholerae,VC）是水产动物中常见的、危害最大的病原菌之一,不仅可引起鱼类严重的脱黏病和细菌性肠炎,而且还可通过水产品感染人类,引起人类烈性肠道传染病。目前控制该病的主要手段是使用抗菌药物,但是由于该菌感染的普遍性、耐药菌株的不断增加,在很大程度上限制了抗菌药物的疗效。因此,该病免疫防治的研究具有重要意义。鉴于霍乱弧菌通过毒素共调菌毛（toxin-coregulated pilus,Tcp）黏附定植于小肠黏膜是其致病的前提,阻断霍乱弧菌的黏附定植即可防止感染的发生。对此,本研究选择暴露于细菌表面并与霍乱弧菌黏附定植密切相关的黏附素TcpA为目标,通过基因工程技术获得重组蛋白GST-TcpA,研究其免疫保护作用,以确定重组TcpA蛋白在霍乱弧菌基因工程亚单位疫苗研制中的应用价值。首先,应用PCR方法从霍乱弧菌Y1菌株基因组DNA中扩增tcpA结构基因并克隆至pMD18-T载体进行序列测定与分析。序列分析显示tcpA结构基因由675个核苷酸组成,开放阅读框完整无中断,编码由224个氨基酸组成的相对分子量约为21 kD的TcpA蛋白。tcpA结构基因在霍乱弧菌Y1菌株与Genbank中登录的20个霍乱弧菌参考株之间均具有较高的同源性,彼此间的核苷酸序列和推导的氨基酸序列同源性分别介于71.8%-99.7%和57.7%-99.3%之间。这些研究结果为tcpA基因的亚克隆和表达奠定了基础。其次,将tcpA基因亚克隆至表达载体pGEX-4T-1并在大肠杆菌BL21（DE3）中表达。根据pGEX-4T-1表达载体阅读框的要求,设计1对包含BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的特异引物,以重组克隆质粒pMD-18T-tcpA为模板,扩增tcpA结构基因。PCR产物经BamHⅠ/XhoⅠ双酶切后,亚克隆到表达载体pGEX-4T-1中,并转化至大肠杆菌BL21（DE3）。pGEX-4T-1-tcpA/BL21重组菌经IPTG诱导后,可以包涵体形式高效表达分子量约47.0 kD的重组蛋白GST-TcpA,并经提纯后获得大量的该重组蛋白,从而为进一步研究其免疫保护作用奠定了基础。最后,分别采用Western blot、细胞黏附抑制试验和免疫保护性试验测定重组蛋白GST-TcpA的抗原性和体内外免疫保护作用。pGEX-4T-1-tcpA/BL21重组菌的诱导表达产物经SDS-PAGE分离后,转移至PVDF膜,以霍乱弧菌菌毛蛋白抗血清为一抗进行Western-blot分析,结果显示重组蛋白GST-TcpA可与菌毛蛋白抗血清发生特异性免疫反应,证实重组TcpA蛋白保持了天然Tcp蛋白的抗原性。以霍乱弧菌菌体、霍乱弧菌菌毛蛋白、重组蛋白GST-TcpA和GST蛋白分别免疫小鼠制备抗血清,检测这四种抗血清在细胞黏附抑制试验中的作用。结果显示菌体抗血清可完全抑制细菌对HEp-2细胞的黏附,菌毛抗血清和重组蛋白抗血清可明显降低细菌对HEp-2细胞的黏附,而GST抗血清无黏附抑制作用。表明重组蛋白抗血清在体外能明显抑制霍乱弧菌Y1菌株对HEp-2细胞的黏附作用,除Tcp外,霍乱弧菌Y1菌株尚表达其它黏附素。实验小鼠分别经纯化重组蛋白GST-TcpA和GST蛋白四次免疫后,用Y1株菌液进行攻击,结果显示重组蛋白免疫组小鼠的免疫保护率为81.25%,而GST免疫组小鼠和生理盐水对照组小鼠全部死亡。说明重组TcpA蛋白对霍乱弧菌感染具有较好的免疫保护作用。综上所述,本研究在成功构建重组表达质粒pGEX-4T-1-tcpA并获得重组蛋白GST-TcpA的基础上,探明了重组TcpA蛋白仍保留了天然Tcp蛋白的抗原性和免疫保护作用,在霍乱弧菌基因工程疫苗的研制中具有潜在的应用价值。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 图表目录
• 本论文主要英文缩写
• 文献综述
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 主要培养基
• 1.1.1 LB培养基
• 1.1.2 含氨苄青霉素的LB琼脂培养基
• 1.1.3 脑心浸液培养基（BHI）
• 1.1.4 定居因子琼脂培养基（CFA）
• 1.2 工程菌及质粒
• 1.3 酶类及主要试剂
• 1.4 实验动物与免疫血清
• 1.5 主要实验仪器
• 1.6 主要溶液配制
• 1.6.1 抗生素母液
• 1.6.2 PBS缓冲液
• 1.6.3 X-gal贮存液
• 1.6.4 琼脂糖凝胶电泳所用溶液
• 1.6.5 感受态细胞制备用溶液
• 1.6.6 SDS-PAGE电泳所需溶液
• 1.6.7 诱导表达及蛋白提纯所用溶液
• 1.6.8 Western-blot实验所用溶液
• 1.6.9 ELISA实验所用溶液
• 1.7 病原菌的分离与鉴定
• 1.8 霍乱弧菌Y1菌株菌毛的提取
• 1.9 鼠抗霍乱弧菌菌毛免疫血清的制备
• 1.9.1 免疫原的制备
• 1.9.2 免疫接种
• 1.9.3 鼠抗菌毛抗体的检测
• 1.10 霍乱弧菌毒素共调菌毛tcpA基因的克隆与序列分析
• 1.10.1 细菌培养与基因组DNA提取
• 1.10.2 引物设计与合成
• 1.10.3 tcpA基因的PCR扩增
• 1.10.4 PCR产物的回收与纯化
• 1.10.5 PCR产物的单酶切鉴定
• 1.10.6 PCR纯化产物与pMD-18T载体的连接
• 1.10.7 感受态细胞的制备
• 1.10.8 连接产物的转化
• 1.10.9 重组克隆质粒的提取
• 1.10.10 重组克隆质粒的鉴定
• 1.10.11 tcpA基因的序列测定与分析
• 1.11 重组质粒pGEX-4T-1-tcpA的构建与鉴定
• 1.11.1 引物设计与合成
• 1.11.2 tcpA基因的PCR扩增与纯化
• 1.11.3 PCR纯化产物与表达质粒的双酶切
• 1.11.4 双酶切产物的回收与纯化
• 1.11.5 tcpA基因与表达质粒的连接
• 1.11.6 连接产物的转化
• 1.11.7 重组表达质粒的提取
• 1.11.8 重组表达质粒的鉴定
• 1.12 重组质粒pGEX-4T-1-tcpA的原核表达
• 1.12.1 重组质粒的诱导表达
• 1.12.2 表达产物的SDS-PAGE分析
• 1.12.3 表达产物的Western-blot分析
• 1.12.4 表达产物的定位与可溶性分析
• 1.12.5 最佳诱导时间的优化
• 1.13 重组蛋白免疫血清的细胞黏附抑制试验
• 1.13.1 重组蛋白GST-TcpA的提取
• 1.13.2 重组蛋白免疫血清的制备
• 1.13.3 细菌培养
• 1.13.4 细胞培养
• 1.13.5 细胞黏附抑制试验
• 1.14 重组融合蛋白的免疫保护试验
• 1.14.1 实验小鼠的免疫
• 1.14.2 免疫小鼠的人工感染试验
• 2 结果与分析
• 2.1 病原菌的鉴定
• 2.2 霍乱弧菌菌毛抗血清的制备
• 2.3 tcpA基因的扩增与PCR产物的酶切鉴定
• 2.4 重组克隆质粒的鉴定
• 2.5 tcpA基因的序列分析
• 2.6 重组质粒pGEX-4T-1-tcpA的构建与鉴定
• 2.7 tcpA基因的诱导表达
• 2.8 表达产物的Western-blot分析
• 2.9 表达产物的定位与可溶性分析
• 2.10 最佳诱导时间的确定
• 2.11 重组蛋白免疫血清的细胞黏附抑制作用
• 2.12 重组蛋白诱导的体内免疫保护作用
• 3 讨论
• 3.1 研制黏附素疫苗是控制细菌性疾病的主要措施之一
• 3.2 重组蛋白GST-TcpA的抗原性
• 3.3 重组蛋白GST-TcpA的免疫保护作用
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 作者简介