论文摘要
目的:两性霉素B（amphotericinB,AMB）是一种治疗深部真菌感染的多烯类抗生素,对绝大多数真性致病性和机会性真菌病有很高的疗效,目前尚无适当的可替代药,仍被喻为治疗真菌感染的“黄金标准”。但临床使用时发现在治疗剂量时会产生比较严重的不良反应,从而使它的应用受到限制。脂质体（liposomes）是一种类似于生物膜结构的双分子层微囊。常规脂质体由磷脂和胆固醇组成的,含有脂质双层,内囊泡为水相。现脂质体技术已发展为一种定向的给药系统,可以作为各类治疗药剂的人工膜和赋形剂。这种微粒具有类细胞结构属于靶向给药系统的一种新剂型,进入人体内主要被网状内皮系统吞噬而激活机体的自身免疫功能,并改变被包封药物的体内分布,使药物主要在肝、脾、肺等组织器官中积蓄,并优先聚集在感染炎症等部位,从而提高药物的治疗指数,减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性。因此,基于以上考虑,本研究采用两性霉素B为模型药物,制备两性霉素B冻干脂质体,以使所输送药物定向释放、减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性、使所包裹药物长效化等。方法:在文献和预实验的基础上初步确定两性霉素B冻干脂质体的制备方法和处方,通过单因素考察初步确定影响脂质体制备因素。对两性霉素B冻干脂质体的制备方法进行研究。采用薄膜分散法、主动载药法、乙醚注入法、逆相蒸发法四种方法制备脂质体,利用葡聚糖凝胶柱对脂质体与游离药物进行分离,测定脂质体两性霉素B的包封率。确定了薄膜分散法为两性霉素B冻干脂质体的制备方法。以包封率和冻干复溶前后脂质体外观、粒径分布和稳定性等为指标,通过单因素考察优化脂质体的制备工艺,并考察类脂材料用量、磷脂胆固醇比例、药物用量和冻干保护剂等对脂质体的影响。在此基础上,采用四因素三水平正交试验设计对各种辅料用量进行筛选,并对评分结果进行分析最后确定脂质体的最佳处方。分别绘制两性霉素B脂质体和两性霉素B溶液的体外释放曲线比较其体外释药过程,并用零级、一级、Higuchi和Weibull方程进行拟合,考察相关系数。以粒径,外观,颜色,氧化指数作为指标,考察了两性霉素B脂质体的物理和化学稳定性。选用大鼠和小鼠作为动物模型,采用高效液相法分别对两性霉素B溶液和脂质体进行药物动力学及小鼠体内分布情况测定。液相条件:色谱柱:DiamonsiLTM ODS C18 （钻石）250×460mm,5μm;预柱:YWG2 C18 10mm×4.6 mm;以乙腈:EDTA-2Na水（0.005mol/L）40:60（PH5.0）为流动相;检测波长:385nm;柱温:37℃;流速:1ml/min。用矩量法进行药代动力学参数处理,计算各种药动学参数。考察两性霉素B脂质体在大鼠体内的药物动力学和小鼠体内分布,并进行了靶向性评价。结果:薄膜分散法所制备的脂质体包封率较高,采用正交设计,最佳处方为磷脂450mg,胆固醇150mg,药液浓度为3.33mg/ml,蔗糖和甘露醇分别为90mg、150mg。所制备薄膜分散法脂质体平均包封率为74.3%,平均粒径为173.5nm,在光镜和透射电镜下呈类圆形,pH值为6.75,粒径大小符合靶向要求。两性霉素B脂质体和两性霉素B溶液的体外释放曲线,分别用零级、一级、Higuchi和Weibull方程进行拟合,考察相关系数。两性霉素B脂质体和溶液体外释药均符合Weibull方程,分别为ln[-ln（1-Q）]=1.395lnt-4.146 ,ln[-ln（1-Q）]=0.6352lnt-3.091,相关系数分别为r=0.9953和r=0.9911。T50为14.82h和3.96h,Td为22.02h和5.17h。由此可知,两性霉素B脂质体较两性霉素B水溶液具有缓释作用。稳定性结果显示:在4℃条件下避光贮存1个月,冻干脂质体外观饱满,呈疏松粉状。复水性良好,形成均匀混悬液。包封率略有下降,粒径变化不大,稳定性较好,说明脂质体需在冷藏避光条件下保存。药动学实验表明:两性霉素B溶液和两性霉素B脂质体静脉给药后,脂质体组与溶液组相比,在大鼠体内的消除半衰期延长,t1/2从6.11h延长至8.25h,AUC显著增高,清除率降低,可显著延长药物在体内的存留时间,从而延长药物到达组织的时间,可显著提高药物疗效。小鼠体内分布实验表明,两性霉素B脂质体较两性霉素B溶液对肝脾和肺靶向性显著提高。溶液组中肝和脾Te分别为0.92和0.32,而脂质体组中Te分别为6.53和6.49,证明了两性霉素B脂质体对肝和脾有靶向作用,达到了设计要求。结论:以两性霉素B为模型药物,以卵磷脂、胆固醇和冻干保护剂为主要材料,采用薄膜分散法制备的冻干脂质体,其制备工艺简单,质量可控。根据药物药理作用特点设计以肝脾和肺为靶点,作为靶向给药的新剂型具有良好的开发前景。
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