论文摘要
自然状态下,茅苍术的体内存在着种类多样的内生真菌,而体外则有相关的根际和叶际微生物与之相伴而生,这些特点使其成为研究植物圈内微生物间互作的合适植物材料。本研究中,我们通过“无菌苗的组织培养——内生菌接种——炼苗——室外盆栽”的方法有效地建立了苍术内生真菌与宿主的双重培养体系,为研究内生真菌在宿主体内互作及内生真菌与宿主共生对植物圈内其他相关微生物的影响奠定了研究基础。首先,为了探讨同一宿主内生真菌侵染过程中的相互影响,以孔球孢霉AL12与小克银汉霉AL4两株茅苍术内生真菌为模式菌株,研究单独接种（AL4组和AL12组）和混合接种内生真菌（AL4/AL12组、AL4VSAL12组和AL12/AL4组）对宿主主要代谢产物挥发油的改变及内生真菌之间对各自定殖分布的影响,并设对照为不接菌（CK组）。结果表明AL4偏好定殖于根茎,而AL12对叶片的定殖更加偏好。混合接菌组中,每种菌的分离率要低于单一接菌组,可能由于真菌之间生态位竞争所致。先接种AL12,再接种AL4会降低AL4的定殖率,同样的,对于茎叶,先接种AL4再接种AL12会减少AL12的定殖率。不同的是在根中单一接种AL12相比于AL12/AL4组和AL4VSAL12组,AL12的定殖率略有下降,可能由于AI4的侵入改变了根中挥发油的含量而有利于AL12的定殖,这在一定程度上表明两种在根中长期定殖的内生真菌间存在协同作用。用染色法对接菌植物组织进行观察,可见单一弯曲,折叠不分支的菌丝体定殖在植物叶片组织和根皮层细胞间。相比纯培养的菌丝,定殖于宿主中的真菌菌丝表现出一定的形态适应性变化。透射电镜更清晰地表明内生真菌定殖于根皮层细胞的细胞壁间。气相色谱结果则表明,单独和混合接种内生真菌均显著提高茅苍术挥发油中苍术素和苍术酮的相对百分含量,特别是AL12/AL4和AL4/AL12两组的苍术素的相对百分含量为同期对照的2倍多,而AL4 VS AL12组的苍术酮的相对百分含量为同期对照的3倍,混合接菌组中宿主挥发油组分的指纹图谱相比对照更加复杂。尽管AL4和AL12在宿主体内有着一定的相互作用,但是它们与茅苍术分别共生后对宿主根际和叶际微生物区系的影响却并不清楚。为此紧接着,我们用AL4和AL12接种茅苍术组培苗,经炼苗将其移种到土壤中,自然生长一年。而后分别使用培养法和非培养法调查各组的根际及叶际微生物群落的差异,通过能谱,高效液相色谱法对叶际的基本元素组成,根际的可溶性糖、游离氨基酸组成和有机酸进行定量。结果表明：内生真菌接种显著提高了根际真菌和细菌的种群大小及群落多样性,且AL4的效应更加显著。不同的内生真菌对叶际微生物的影响并不一致,AL4组叶际细菌的种群大小及群落多样性最大,而AL12组的叶际真菌的种群大小及多样性最大。在内生真菌接种组中,微杆菌Microbacterium,考克氏菌Kocuria和鞘氨醇单胞菌Sphingomonas为优势细菌属,而不动杆菌Acinetobacter为对照组的优势细菌属。镰刀菌Fusarium和青霉菌Penicillum为茅苍术根际和叶际的优势真菌属,但内生真菌接种组中,两种真菌在叶际区的种群大小有所下降,分别被优势真菌枝顶孢Acremonium和弯孢霉Curvularia所替代。不同的内生真菌接种改变了宿主叶际基本元素及根际分泌物的组成。这些由内生真菌介导的植物叶际、根际分泌物的变化可能作为植物圈微生物群落结构变化的主要诱因。本实验首次以茅苍术为植物体系,经组培苗接种内生真菌——炼苗——自然生长一年,系统研究内生真菌定殖宿主体内对宿主植物圈相关微生物的影响,并且从真菌介导植物变化的角度探寻植物圈微生物群落变化的可能原因,为植物圈微生物群落变化、演替提供借鉴。结合内生真菌在宿主体内互作的生态学研究,系统研究了内生真菌主要参与下的植物圈范围内的微生物间互作及影响。最后,我们筛选得到一株茅苍术叶部的优势内生真菌AL16,该菌可稳定定殖于茅苍术幼苗的地上及地下部分,并可显著提高组培苗炼苗存活率。经分子和形态学鉴定为直立枝顶孢Acremonium strictum,并发现其含有一种特殊的产孢结构。我们将接种内生真菌和无内生真菌接种的幼苗分别放置于三种水分处理条件下（对照组正常浇水、中度干旱组为PEG6000-10%、重度干旱组为PEG6000-30%）比较内生真菌接种与否对宿主应对干旱胁迫的影响。结果表明AL16在中度干旱的条件下,可提高叶片可溶性糖,蛋白,脯氨酸含量及三种抗氧化酶活力；减轻脂质过氧化程度；提高根部和叶部脱落酸的含量；增加根冠比来帮助宿主应对干旱胁迫。而在正常浇水及重度干旱条件下,内生真菌的以上作用均不显著,甚至在有些方面有害。本研究为探索内生菌协助药用植物抵抗干旱等不利气候因素提供了理论基础。
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