Pseudomonas putida DLL-E4对硝基苯酚代谢途径中1，2，4-苯三酚1，2-双加氧酶基因的功能分析

论文摘要

对硝基苯酚（PNP）是重要的环境污染物,进入环境的PNP会长期残留在深层土壤和地下水中,对动植物和人类的健康造成了严重的危害。大量能够降解PNP的微生物被分离,同时在微生物许多种属中的PNP代谢途径已经得到相应的研究,但是,相应的与PNP降解相关的基因的研究却报道甚少,特别是在革兰氏阴性菌中。本研究以本实验室分离PNP降解菌株Pseudomonas putida DLL-E4为材料,通过SEFAPCR扩增已知的部分序列1,2,4-苯三酚1,2-双加氧酶基因（pnpC）的侧翼序列。通过在NCBI的功能比对和开放阅读框（ORF）寻找以及生物学软件BioEdit开放阅读框寻找,获得了pnpC的全序列。1,2,4-苯三酚1,2-双加氧酶PnpC,不论在NCBI比对还在进化关系上都与1,2,4-苯三酚1,2-双加氧酶亲缘关系较近,可以归为1,2,4-苯三酚1,2-双加氧酶。为了验证pnpC的功能,我们利用表达载体pET-29b对pnpC在大肠杆菌BL21中进行了表达。通过SDS-PAGE电泳分析,成功表达了pnpC。PnpC的功能是催化1,2,4-苯三酚生成maleyacetate,PnpC能够微弱地催化邻苯二酚,但不能利用对苯二酚和间苯二酚。PnpC催化1,2,4-苯三酚,最适pH是7.5,最适温度是30℃。加入螯合剂EDTA会使酶活下降为原来的35.84%,金属离子对酶活性影响很大,Li+和Zn2+Mn2+,Fe3+,Cu2+,Fe2+对酶有较高的激活作用,其中Fe2+对酶活力的激活最高。而Cd2+,Ni2+,Co2+对PnpC有抑制作用,因此PnpC有可能是金属酶。为了验证pnpC在DLL-E4代谢PNP中的功能,在DLL-E4中对pnpC进行了敲除。通过对pnpC侧翼区进行PCR扩增,酶切pnpC绝大部分序列,获得了pnpC缺失序列并克隆至sacB自杀性质粒载体pJQ200SK中,与原始菌株DLl-E4接合后进行同源重组的方法,筛选获得了pnpC插入失活突变子DLL-△pnpC1和缺失突变子DLL-△pnpC。pnpC插入失活菌株DLL-△pnpC1只能微弱降解PNP,DLL-△pnpC并没有失去降解PNP和对苯二酚的能力,只是在降解速率上有所下降。通过分析PNP诱导的DLL-E4和DLL-△pnpC不同硫酸铵沉淀梯度下的粗酶液对邻苯二酚的活性,发现PNP诱导的DLL-△pnpC粗酶液相对于DLL-E4的有新的活性沉淀区间出现,说明在DLL-E4中存在另一个与开环相关的双加氧酶,替代敲除的pnpC的功能,使得DLL-ApnpC的PNP完整代谢得以维持。PnpC活性分析研究结果表明其最适底物为1,2,4.苯三酚,同时该酶不能利用对苯二酚,结合本试验的结果,即PnpC确实为DLL-E4降解PNP的关键基因。又因刘智通过GC-MS确认对苯二酚为DLL-E4代谢PNP过程中的中间代谢产物。故我们推测DLL-E4中存在一条与革兰氏阴性细菌中常见的对苯二酚途径不同的PNP代谢方式,具体过程如下,PNP在单加氧酶的作用下生成对苯二酚,对苯二酚在羟化酶的作用下生成1,2,4.苯三酚,l,2,4一苯三酚在PnpC的作用下开环,进入相应循环,这个推测还需要具体的试验结果进行验证。通过分析PNP和邻苯二酚诱导的DLL-E4的不同硫酸铵沉淀梯度下的粗酶液对邻苯二酚的活性,发现PNP和邻苯二酚诱导的DLL-E4产生的粗酶液是不同酶系的,说明在DLL-E4体内存在中另一个1.2.4.苯三酚双加氧酶。通过从NCBI上下载已报道风eudomonas属的邻苯二酚1,2.双加氧酶蛋白质序列。通过生物学软件比对,找到保守区间,设计引物,成功的从DLL-E4基因组DNA中扩增出两个不同邻苯二酚1,2-gX.加氧酶基因部分序列,为全面研究苯环类物质在DLL-E4降解奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号与缩略语说明
• 前言
• 文献综述
• 一、环境污染物:对硝基苯酚
• 二、对硝基苯酚微生物降解的研究进展
• 三、Ring-Cleaving dioxygenase的研究进展
• 四、侧翼序列克隆方法
• 参考文献
• 第一章 DLL-E4中1,2,4苯三酚1,2-双加氧酶基因的克隆和功能分析
• 1.材料与方法
• 2.结果与分析
• 3.讨论
• 4.结论
• 参考文献
• 第二章 DLL-E4对硝基苯酚降解途径关键基因pnpC的突变分析研究
• 1.材料与方法
• 2.结果与分析
• 3.讨论
• 4.结论
• 参考文献
• 全文总结
• 本文创新之处
• 附录一 文中所用培养基及试剂配方
• 附录二 研究中获得的相关DNA序列
• 致谢