论文摘要
细胞缺氧是许多疾病条件下最常见的病理生理现象之一,是导致烧创伤后组织脏器损害的重要因素。能量代谢障碍是缺氧导致细胞和组织器官损害的根本原因。在缺氧早期,心肌细胞即启动内源性能量保护机制以增强细胞对缺氧损害的耐受,这对于有机体的存活起到决定性的作用。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase AMPK）是细胞能量状态的中心感受器和调节器。一旦被激活,AMPK会通过直接磷酸化下游调节蛋白或间接影响基因表达等方式,抑制消耗ATP的能量消耗途径（如抑制脂肪合成,胆固醇合成,蛋白合成等）,并激活ATP的能量产生途径（如增加糖酵解、葡萄糖摄取、抑制,促使线粒体酶活性增加及线粒体增生,使氧化磷酸化效率提高等）来阻止细胞内ATP的进一步消耗,从而产生能量保护效应,提高细胞的抗缺氧能力,在维持缺氧细胞能量稳态和诱导适应性反应中扮演关键角色。AMPK有两种激活方式,除了被细胞内增多的AMP变构激活外,被其上游激酶（AMPK Kinase）磷酸化激活是更为重要且必不可少的激活方式。脯氨酸羟化酶（prolyl hydroxylase domain—containing proteins,PHDs）是近年发现的重要缺氧感受器,使用PHD抑制剂（PHI）抑制PHD会诱导细胞产生广泛的缺氧保护性反应。结合这些研究进展,我们提出假设:1.在缺氧早期,心肌细胞中AMPK的活化很可能先于AMP/ATP比率升高,在尚未出现明显的能量代谢障碍之前即启动内源性能量保护机制。2.缺氧信号有可能通过缺氧感受器脯氨酸羟化酶（PHDs）经AMPKK途径激活AMPK,由此,使用PHD的抑制剂（PHI）激活PHD级联也极有可能在不产生明显干扰的前提下激活心肌细胞中AMPKK-AMPK途径。目前早期缺氧对心肌细胞中AMPK级联的活化途径尚不明确,激活PHD途径对AMPK级联的影响国内外尚未见报道。本研究拟在离体原代培养的大鼠心肌细胞模型上,应用HPLC、western blot,体外激酶反应等现代分子生物学的方法,探讨缺氧早期心肌细胞内AMPK途径活化的方式,从PHI入手了解其对常氧心肌细胞中AMPK途径活化的影响及其在改善缺氧心肌细胞能量状态、影响心肌细胞抗缺氧能力方面的作用,并探讨PHI激活AMPK的分子机制,目的在于证明心肌细胞中PHI-AMPKK-AMPK途径的存在并探讨其作用机制。力图从全新的角度探讨缺氧条件下心肌细胞的内源性能量保护的发生机制与上游调控环节。从而为临床防治心肌缺血缺氧性损害提供新的手段和理论依据。一、材料方法1.建立大鼠原代心肌细胞缺氧模型,应用高效液相色谱检测心肌细胞中能量状态的变化,Western blot检测心肌细胞中的AMPK、ACC的蛋白含量以及各自磷酸化程度的变化;通过制作原核表达的AMPKα11-312蛋白并进行体外激酶反应进一步证明早期缺氧激活心肌细胞中AMPK的途径。2.应用HPLC, Western blot,心肌细胞活力测试等方法,通过在大鼠原代心肌细胞模型上观察2种PHI对细胞内ATP,AMP及AMP/ATP比率的影响、AMPK及其下游底物ACC磷酸化蛋白含量的影响以及PHI预处理对缺氧12h心肌细胞内ATP含量和细胞活力的影响。探讨2种PHI对心肌细胞种AMPK途径的激活作用及激活途径,观察PHIs预处理对改善缺氧条件下大鼠心肌细胞能量状态及活力的作用及其与PHI-AMPK途径的相关性。3.通过应用激光共聚焦,Western blot,免疫共沉淀,体外激酶反应等方法,在体外培养的大鼠心肌细胞模型上,观察2种PHI对心肌细胞种ROS,[Ca2+]i浓度变化的影响,并应用各种抑制剂探讨心肌细胞中PHI-AMPKK-AMPK途径的具体机制。二、主要结果与结论1.缺氧早期（缺氧1h以内）心肌细胞中高能磷酸物质（ATP, AMP, AMP/ATP比率）与常氧条件下相比无明显变化。而在缺氧5min时心肌细胞中AMPK途径活力即明显增高,AMPK活力与p-AMPK呈显著正相关,而与细胞内AMP/ATP比率无明显相关关系。体外激酶反应说明缺氧早期（5-15min）心肌细胞中AMPKK活力显著增高且与AMP变构调节无关。提示AMPKK-AMPK途径是早期缺氧激活心肌细胞AMPK级联的主要途径,而非传统认为的AMP变构激活。2.使用PHIs处理心肌细胞可在不产生明显代谢干扰的前提下通过AMPKK途径磷酸化激活AMPK,该作用可被AMPK特异性抑制剂阻断。用PHIs预处理可显著增加缺氧12h心肌细胞内ATP含量和细胞生存率,且该效应亦可被AMPK特异性抑制剂CC显著阻断。实验结果说明,PHIs对心肌细胞中AMPK途径的磷酸化激活是其显著改善缺氧细胞能量状态、提高缺氧心肌细胞生存率的主要原因。3. DMOG对大鼠心肌细胞ROS/RNS的产生没有影响; EDHB虽然可以在大鼠心肌细胞中激活NO-mitoKATP途径,从而增加mitoROS以及RNS的产生,但ROS清除剂NAC,NOS抑制剂L-NAME以及线粒体KATP通道抑制剂5-HD都不能有效阻断EDHB诱导的AMPK途径磷酸化激活。说明ROS和RNS显然都不是EDHB激活AMPK途径的上游机制。4. PHIs可显著增加心肌细胞内钙离子浓度,使用钙离子螯合剂预清除细胞中的Ca2+可阻断PHI-AMPK途径,而使用钙离子诱导剂增加细胞中Ca2+则能模仿PHIs导致AMPK磷酸化增加。免疫共沉淀结果显示,PHIs处理后心肌细胞中CaMKKα与AMPK亲合力增加,提示PHIs可导致AMPK与CaMKK相互作用更加频繁。使用CaMKK抑制剂可显著阻断PHIs对AMPK以及ACC的磷酸化激活作用。由此可证明2种PHIs是通过Ca2+-CaMKK-AMPK途径激活心肌细胞中AMPK。