论文摘要
肺纤维化是一种慢性炎症间质性疾病，其特征是肺泡区细胞结构的改变伴随过度的胶原沉积。肺纤维化的病因还未完全清楚，已有大量证据表明，活性氧（reactive oxygen species，ROS）在不同形式的肺损伤过程中扮演了重要角色，除了刺激炎症反应的发生外，更重要的是大量ROS的爆发破坏了体内氧化-抗氧化的平衡，使机体失去正常的调节功能，从而对正常细胞及组织造成损伤并引发过度修复。Nuclea r factor-erythroid 2 related factor 2（Nrf2）是一种新近发现的转录因子，它可以启动多种抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的活化。在肺纤维化的发病过程中，Nrf2及其下游相关的基因发生了什么变化，它与炎症反应和胶原代谢之间的关系如何，给与药物干预后是否能增强Nrf2的转录激活进而上调肺部抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶基因的表达以发挥保护作用，以及这些变化对于最终的病理改变起到何种影响都不十分清楚。因此，研究此通路的变化及其调控作用机制对于深入探讨肺纤维化的发病机理与防治策略具有重要意义。本研究通过建立博来霉素诱发的小鼠肺纤维化模型，测定肺纤维化过程中氧化应激的相关指标，利用RT-PCR和Western Blot技术观察Nrf2及抗氧化酶CAT、SOD、GCS与HO-1 mRNA与蛋白表达的变化，体外原代培养肺成纤维细胞，MTT法测定其活力与胶原分泌情况；通过加入H2O2、博来霉素（BLM）和咖啡酸苯乙酯（CAPE），观察它们单独或联合对L929小鼠胚肺成纤维细胞增殖及胶原合成量的影响，荧光免疫细胞化学法观察Nrf2在胞内的分布情况，EMSA检测其DNA结合能力，观察Nrf2及抗氧化酶CAT、SOD、GCS与HO-1 mRNA与蛋白表达的变化，同时流式细胞仪检测细胞内活性氧的生成情况；采取常规药物地塞米松与抗氧化剂咖啡酸苯乙酯单独或联合对动物模型进行干预治疗，观察实验性治疗效果，为深入研究肺纤维化的发病机理，进一步提高临床疗效和健康需要，提供初步的实验资料和理论依据。通过本实验结果观察到：（1）在给予动物BLM作用后，肺/体比值升高，肺部纤维化表现明显，羟脯氨酸含量显著增加，说明肺纤维化动物模型制作成功。同时发现，脂质过氧化产物TBARs升高，抗氧化物质GSH减少，而抗氧化酶SOD、CAT活性也逐渐下降，说明体内存在氧化应激。通过测定发现，肺组织中关键转录因子Nrf2及抗氧化酶的mRNA与蛋白表达都发生明显变化，说明这些基因可能调控着肺部氧化－抗氧化的平衡。另外还发现，模型动物的成纤维细胞增殖活力比对照组高，而与胶原代谢相关的MMP-1/TIMP-1比例也发生改变，说明肺纤维化中存在成纤维细胞状态与功能的改变。（2）在给予体外培养的L929成纤维细胞低剂量的氧化剂BLM与H2O2时，都可刺激细胞增殖并且胶原分泌增加。同时发现，BLM与H2O2均可上调细胞内的Nrf2 mRNA的表达，但BLM对Nrf2的蛋白与活性下调，H2O2对Nrf2的蛋白表达与活性仍然显示出上调作用。细胞内的重要抗氧化酶CAT、SOD、γ-GCS、HO-1的表达也发生变化，且变化趋势与Nrf2相似。另外，通过对胞内氧化应激指标的观察发现，BLM与H2O2引起脂质过氧化产物TBARs的含量增加，CAT、SOD的活性下降，GSH含量降低。给予抗氧化剂，能够上调Nrf2的表达，影响抗氧化酶表达发生变化，并提示可能存在剂量效应关系，能够改善BLM与H2O2所导致的氧化应激的状态，同时细胞的增殖活力与胶原分泌也得到抑制。另外，通过RNA干涉沉默Nrf2基因后，发现几种抗氧化酶对药物的敏感性均明显减弱，说明Nrf2是其表达与活性的核心因子。（3）Nrf2及抗氧化酶的表达变化与H2O2的浓度有一定关联，氧化剂与抗氧化剂都会影响胞内的H2O2浓度，CAT变化的不一致提示Nrf2与H2O2存在反馈调节。低浓度的H2O2会刺激细胞增殖，令胞内氧化－抗氧化状态改变。（4）CAPE可以调控Nrf2与抗氧化酶，控制胞内关键信号分子H2O2的浓度，改善BLM与H2O2对成纤维细胞的刺激作用，从而实现对肺成纤维细胞状态的调节，它对Nrf2的活化机制可能与其结构有关。CAPE对肺纤维化动物模型有一定的治疗效果。（5）发现BLM致肺纤维化作用可能存在的新机制在于其对Nrf2或抗氧化酶的蛋白毒性。本课题通过博来霉素诱发的肺纤维化动物模型，初步探讨了ROS介导的以Nrf2为核心的抗氧化防御体系对肺纤维化的调控机制，并且取得了一定进展。发现ROS可以通过调节Nrf2介导的抗氧化酶的改变影响肺成纤维细胞的状态与功能。H2O2是机体调控氧化－抗氧化平衡的关键分子，阐明ROS介导的以Nrf2为核心的抗氧化防御系统的改变是肺纤维化中氧化－抗氧化失衡的主要原因，同时观察到抗氧化剂CAPE可以通过激活Nrf2介导的抗氧化防御体系而产生一定治疗效果，以及BLM致肺纤维化作用可能存在的新机制在于其对Nrf2或抗氧化酶的蛋白毒性。从而为探索纤维化发生机制提供了重要实验依据，也为肺纤维化疾病的抗氧化治疗提供了重要线索。