水稻黄单胞菌致病相关基因hpa2的研究

论文摘要

植物病原细菌水稻黄单胞引起水稻病害,包括水稻白叶枯病和水稻细条斑病。水稻白叶枯病由水稻黄单胞白叶枯致病变种引起,是水稻上最严重的病害之一;水稻细条斑病由水稻黄单胞细条斑致病变种引起,是在水稻主产区逐渐流行的一个重要病害。作为重要的植物病原,水稻黄单胞菌的侵入机制还没有被很好地阐明。病菌与寄主互作的过程与经过分泌系统泌出的效应蛋白相联系。在植物病原细菌中,Ⅲ型泌出通道是一个重要的分泌系统。这个系统涉及病原致病性,过敏性反应,以及效应蛋白的分泌。在植物病原黄单胞菌中,引起过敏反应和致病性的蛋白由其hrp基因簇上的基因编码,这些蛋白包括Hrc蛋白、Hrp蛋白和Hpa蛋白等。hrc基因共有11个,即hrcC、T、N、L、J、U、V、Q、R、S和D,这些基因对应的Hrc蛋白是Ⅲ型泌出系统的组成成分。hrp基因共有9个,即hrpB7、B5、B4、B2、B1、D5、D6、E和F。hpa基因共有8个,即hpa2、1、P、A、B、4、3和F。已经确定,在hrp基因簇一些操纵子的启动子区域含有植物诱导的PIP盒,即一个保守的序列TTCGC-N15-TTCGC。这个PIP包括完整的PIP盒和不完整的PIP盒。为了研究hpa2基因的功能,我们选定了5个水稻黄单胞菌菌株,即Xanthomonasoryzae pv.oryzae PXO99（Xoo PXO99）、Xanthomonas oryzae pv.oryzae ZHE173（XooZHE173）、Xanthomonas oryzae pv.oryzae JXOⅢ（Xoo JXOⅢ）、Xanthomonas oryzaepv.oryzicola HAN1（Xooc HAN1）和Xanthomonas oryzae pv.oryzicola RS105（XoocRS105）,克隆得到相应的hpa2基因。对这些基因及其推测的氨基酸序列进行分析,结果表明:具有712 bp的hpa2基因由564 bp的ORF区域和148 bp的启动子区域构成,在水稻黄单胞菌中高度保守。在启动子区域的上游都存在一个相同的不完整的植物诱导的PIP盒,即TTCGC-N15-TTCGT。在核苷酸序列中,只有个别碱基发生变化。在启动子区域,菌株Xooc HAN1只有一个碱基被替换,即G80→A80。在ORF区域,菌株Xooc RS105有三个碱基被替换,即C430→T430,T592→C592,T673→C673。菌株XooPXO99有两个碱基被替换,即A601→T601,A618→G618。由于密码子的简并性,这五个hpa2基因编码一致的氨基酸序列。蛋白质数据库搜索结果显示,Hpa2蛋白的氨基酸序列中含有可溶性的裂解转糖基酶（Soluble Lytic Transglycosylase,SLT）的功能域。在酶分子中,具有总酸碱催化能力的氨基酸残基有七个,即谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、酪氨酸、半胱氨酸和组氨酸等。它们在Hpa2蛋白中的含量为30.5%,接近于在SLT70中28.6%的含量和在T4噬菌体溶菌酶（Enterobacteria phage T4 Lysozyme,T4L）中32.3%的含量。使用pET-30a（+）载体,我们成功地表达了来自Xoo PXO99菌株hpa2基因564 bp的ORF,得到了一个Hpa2蛋白。该蛋白含有187个氨基酸,分子量为20.8 kDa,等电点为9.62。与推算的结果相一致,Hpa2蛋白呈现强碱性,在pH10.1的TE缓冲液中,能够提取到足量的Hpa2蛋白。为了研究Hpa2蛋白的分泌特性,我们将Hpa2蛋白的过量表达菌株564-6与菌株Micrococcus luteus进行了共培养,观察OD600值的变化情况。与菌株M.luteus的单独培养相比较,共培养菌液的OD600值没有发生明显的变化;而与含有Hpa2蛋白的两个正对照相比却发生了明显的变化。这表明,Hpa2蛋白没有从它的过量表达菌株E.coli的细胞内分泌至细胞外。我们对M.luteus、Clavibacter michiganense subsp.sepedonicum、Bacillus subtilis、Escherichia coli、Xoo PXO99和Xooc RS105等六个菌株分别进行了含有Hpa2蛋白上清液、含有pET-30a（+）载体的上清液（阴性对照）、溶菌酶（阳性对照）和pH值为6.8的TE缓冲溶液（阴性对照）的处理。对所有处理液的6个时间段,即2、4、6、8、10和12小时,分别进行了OD600值的测定。结果显示,随着处理时间的延长,所有处理液的OD600值都有下降的趋势。与两个阴性对照相比,经溶菌酶和Hpa2上清液处理的都发生了明显的变化。但是,两种处理变化的情况不同。除M.luteus外,溶菌酶与Hpa2上清液处理的OD600变化趋势存在差异。在2小时后,对于C.m.subsp.sepedonicum、E.coli和Xoo PXO99菌株,Hpa2上清液低于溶菌酶的OD600值。在8小时以后,而对于C.m.subsp.sepedonicum和E.coli菌株,Hpa2上清液却高于溶菌酶的OD600值。这一结果表明的Hpa2的酶动力性高于溶菌酶,但酶活性要低于溶菌酶。与另外五个菌株的变化趋势相比,M.luteus菌株4个处理溶液的OD600值一直呈稳定变化的趋势。在所有时间段里,溶菌酶处理的OD600值都明显低于Hpa2上清液。在8小时之前,溶菌酶和Hpa2上清液与两个阴性对照[TE缓冲溶液和pET-30a（+）上清液]相比,都明显降低。但在10小时之后,Hpa2上清液与两个阴性对照相比,却无差异。综合上述OD600值测定结果,我们得出结论:Hpa2蛋白对供试的6个细菌菌株都具有溶菌作用,但对不同菌株的溶菌活性有差异。M.luteus、C.m.subsp.sepedonicum和B.subtilis为革兰氏阳性菌;E.coli、Xoo PXO99和Xooc RS105为革兰氏阴性菌。这说明,Hpa2蛋白对不同类型的细菌都具有溶解活性。为了进一步确定Hpa2蛋白溶解细菌细胞的位点,根据上述实验结果,我们选定了M.luteus作为供试菌株。经过Hpa2蛋白处理后,在透射电子显微镜下观察,细菌的细胞壁明显地被裂解。细胞壁由光滑变为凹凸形状,部分被毁坏,甚至呈现崩溃的、细胞内物质溢出的状态。这说明,Hpa2蛋白能够裂解细菌的细胞壁。为了更好地探明Ⅲ型泌出系统与hpa2基因的关系,我们利用自杀性的敲除载体pKNOCK-Cm和具有功能互补作用的粘粒载体pUFR034,构建了hpa2基因的突变载体pKNO464-16和互补载体pUFRcom712-22,并筛选得到hpa2基因的突变体464-16及其功能互补子712-22。对突变体和互补转化子进行水稻接种,观察植株反应情况。接种水稻的观察结果:突变菌株接种叶片的病斑明显小于野生菌株Xoo PXO99的病斑,互补菌株的病斑虽然比野生菌株的小,但比突变菌株的大。细菌繁殖的增长量测定结果:在水稻叶片中,接种两天后的野生菌株细胞的增长量大约为1000倍,突变体的大约为10倍,互补的大约为100倍。接种非寄主的结果:突变体不能诱导烟草、番茄和辣椒产生HR,但可以诱导大白菜产生HR。上述结果表明,hpa2基因能够在水稻上引起致病性,可以在某些非寄主植物上引产生敏性反应,也有个别非寄主植物不能产生过敏性反应。综合全部实验结果,我们得出结论:Hpa2蛋白在水稻黄单胞菌中是保守的,对细菌细胞壁具有裂解活性。我们推测Hpa2蛋白通过拉大细菌细胞壁肽聚糖网络孔洞的方式辅助Ⅲ型泌出系统的装配。这表明hpa2基因可以通过TTSS起作用,进而影响病菌的致病性。Hpa2是Hrp蛋白家族中第一个被鉴定的具有裂解活性的蛋白,所以,我们的实验结果有助于更好地理解细菌与寄主的互作关系。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语及其英（拉）汉对照
• 引言
• 上篇 文献综述
• 第一章 植物病原细菌hrp基因簇和致病岛
• 1.1 概述
• 1.2 hrp基因的发现及分布
• 1.3 hrp基因的功能及hrp基因簇
• 1.4 植物病原细菌的致病岛
• 第二章 病原细菌Ⅲ型泌出系统研究进展
• 1.1 概述
• 1.3 Ⅲ型泌出系统的遗传组成
• 1.4 Ⅲ型泌出系统的底物
• 1.5 植物病原细菌的Harpin蛋白
• 1.6 Ⅲ型泌出系统的效应蛋白
• 第三章 植物病原细菌Ⅲ型泌出系统的调节机制
• 1.1 概述
• 1.2 hrp基因表达的调节
• 1.3 效应蛋白分泌的调节
• 第四章 细菌的裂解转糖基酶研究现状
• 1.1 裂解转糖基酶的概念
• 1.2 细菌的裂解转糖基酶分类
• 1.3 细菌的裂解转糖基酶的结构及其作用机制
• 1.4 裂解转糖基酶与细菌运输系统的关系
• 下篇 研究内容
• 第五章 水稻黄单胞菌hpa2基因的保守性
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株和质粒
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 培养基
• 1.1.4 核酸电泳缓冲液
• 1.1.5 主要仪器设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 水稻黄单胞菌基因DNA的提取
• 1.2.1.1 培养液的准备
• 1.2.1.2 基因组DNA的提取
• 1.2.1.3 基因组DNA的检测
• 1.2.2 目的DNA扩增引物的设计与合成
• 1.2.3 目的DNA的扩增及其产物纯化
• 1.2.3.1 目的DNA的PCR扩增
• 1.2.3.2 PCR扩增产物的纯化
• 1.2.4 PCR扩增产物的克隆
• 1.2.4.1 扩增产物DNA片段与克隆载体的连接
• 1.2.4.2 E.coli DH5α感受态的制备
• 1.2.4.3 连接产物的热激转化
• 1.2.5 目的基因hpa2的检测
• 1.2.5.1 质粒的提取
• 1.2.5.2 质粒的酶切
• 1.2.5.3 克隆DNA片段的测序
• 1.2.6 Hpa2氨基酸分析的方法
• 2 实验结果
• 2.1 hpa2基因保守性
• 2.2 hpa2基因密码子简并性
• 2.3 Hpa2蛋白总酸碱催化残基含量分析
• 2.4 Hpa2氨基酸序列分析
• 3 讨论
• 第六章 水稻黄单胞PXO99菌株Hpa2蛋白活性
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株和质粒
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 培养基
• 1.1.4 蛋白提取缓冲液
• 1.1.5 蛋白电泳缓冲液
• 1.1.6 蛋白电泳胶染色液
• 1.1.7 蛋白电泳胶脱色液
• 1.1.8 蛋白溶菌反应缓冲液
• 1.1.9 主要仪器设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 hpa2基因表达载体的构建
• 1.2.1.1 564 bp ORF引物的设计与合成
• 1.2.1.2 目的DNA 564 bp的PCR扩增
• 1.2.1.3 扩增片段564 bp的克隆
• 1.2.1.4 目的DNA片段564 bp连入表达载体
• 1.2.1.4.1 目的DNA片段的酶切及纯化
• 1.2.1.4.2 目的DNA片段连接入表达载体
• 1.2.1.4.3 E.coli BL21（DE3）菌株感受态的制备
• 1.2.1.4.4 连接产物的克隆
• 1.2.2 Hpa2蛋白表达及其检测
• 1.2.2.1 Hpa2蛋白的提取
• 1.2.2.2 Hpa2蛋白SDS-PAGE
• 1.2.2.3 Hpa2蛋白的定量测定
• 1.2.3 Hpa2蛋白分泌的测定
• 1.2.4 Hpa2蛋白溶菌的测定
• 1.2.5 Hpa2蛋白对细菌细胞壁裂解的观察
• 2 实验结果
• 2.1 Hpa2蛋白的基本特性
• 2.2 Hpa2蛋白的溶菌效果
• 3 讨论
• 第七章 hpa2基因在病原与植物互作中的作用
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株和质粒
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 培养基
• 1.1.4 核酸电泳缓冲液
• 1.1.5 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 Xoo PXO99菌株hpa2基因突变载体的克隆
• 1.2.1.1 设计引物
• 1.2.1.2 目的片段464 bp的PCR扩增
• 1.2.1.3 扩增片段464 bp的克隆
• 1.2.1.4 自杀载体的构建
• 1.2.1.4.1 DNA的酶切及纯化
• 1.2.1.4.2 464 bp DNA片段连接入自杀载体pKNOCK-Cm
• 1.2.1.4.3 E.coli S17-1 λpir菌株感受态的制备
• 1.2.1.4.4 连接产物转化入自杀载体
• 1.2.2 hpa2基因突变体的筛选
• A菌株感受态细胞的制备'>1.2.2.1 PXO99^A菌株感受态细胞的制备
• A菌株感受态细胞电转化'>1.2.2.2 PXO99^A菌株感受态细胞电转化
• 1.2.3 hpa2基因突变体的分子检测
• 1.2.4 hpa2基因全长712 bp的克隆
• 1.2.4.1 引物的设计与合成
• 1.2.4.2 目的片段PCR扩增
• 1.2.4.3 扩增产物的克隆
• 1.2.5 hpa2基因互补载体的构建
• 1.2.5.1 DNA的酶切及纯化
• 1.2.5.2 目的DNA片段连接入互补载体
• 1.2.5.3 构建载体的转化
• 1.2.6 hpa2基因互补转化子的筛选
• 1.2.6.1 互补载体质粒提取
• 1.2.6.2 互补转化子的筛选
• 1.2.7 突变菌株接种植物体分析
• 1.2.7.1 菌株的培养
• 1.2.7.2 植物的准备
• 1.2.7.3 接种植物
• 1.2.7.4 细菌繁殖的记数
• 2 实验结果
• 2.1 突变菌株464-16的获得
• 2.2 互补菌株712-22的获得
• 2.3 hpa2基因在寄主植物上引起致病性
• 2.4 hpa2基因在非寄主植物上产生过敏性反应
• 3 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 附录一 水稻黄单胞PXO99菌株hrp基因簇的克隆及其hrf基因突变载体的构建
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株和质粒
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 培养基
• 1.1.4 核酸电泳缓冲液
• 1.1.5 主要仪器设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 水稻黄单胞菌株Xoo PXO99基因组DNA的提取
• 1.2.1.1 培养液的准备
• 1.2.1.2 基因DNA的提取
• 1.2.1.3 基因DNA的检测
• 1.2.2 目的DNA扩增引物的设计与合成
• 1.2.3 目的DNA的扩增及其产物纯化
• 1.2.3.1 目的DNA的PCR扩增
• 1.2.3.2 PCR扩增产物的纯化
• 1.2.4 PCR扩增产物的克隆
• 1.2.4.1 扩增产物DNA片段与克隆载体的连接
• 1.2.4.2 E.coli DH5α感受态的制备
• 1.2.4.3 连接产物的热激转化
• 1.2.5 目的DNA片段的检测
• 1.2.5.1 质粒的提取
• 1.2.5.2 质粒的酶切
• 1.2.5.3 克隆DNA片段的测序
• 1.2.6 hrf基因旁侧同源序列扩增引物的设计与合成
• 1.2.7 hrf基因旁侧同源序列产物扩增、纯化、克隆及其检测
• 1.2.8 标记交换基因cat的制备
• 1.2.9 hrf基因旁侧同源序列cat基因连入载体pKNG101
• 1.2.10 突变载体的检测
• 2 实验结果
• 2.1 hrp3223的序列分析
• 2.2 hrf基因突变载体的构建
• 3 讨论
• 附录二 本论文涉及质粒的图谱及其特性
• 附录三 主要参考网站
• 附录四 登录NCBI的序列
• 攻读博士学位期间发表论文
• 致谢