论文摘要
苎麻花叶病毒（Ramie mosaic virus, RaMoV）是双生病毒科（Geminiviridae）菜豆花叶病毒属（Begomovirus）的双组份双生病毒,在自然界以RaMoVA/ RaMoVB病害复合体的形式侵染寄主。至今已在湖南、江苏和浙江的苎麻及福建的普通烟草上检测到该种病毒。本文所用毒源RaMoV F3分离物是从福州田间表现出矮化、卷叶和脉肿的普通烟草上分离得到病毒。双组份双生病毒在寄主植物细胞内的运动依赖于DNA-B组分BV1编码的核穿梭蛋白（nuclear shuttle protein, NSP）和BC1编码的运动蛋白（movement protein, MP）。因此,制备NSP的多克隆抗体对于研究病毒在寄主内的侵染和运动机制具有重要意义。本文s经克隆RaMoV的BV1基因、利用pET-28a（+）构建表达载体,转化原核表达细胞Escherichia coli BL21（DE3）,IPTG诱导表达NSP,将此蛋白割胶研磨后,免疫新西兰白兔,制备了抗NSP的多克隆抗体。ELISA检测抗体的滴度为1:32000,Western blotting结果显示该抗体能与NSP发生特异性结合反应。在本氏烟中,通过PVX异源载体和瞬时表达技术,进行了RaMoV编码蛋白的致病性研究。结果表明,A组分AV2编码的蛋白和B组分BV1编码的NSP为致病因子,接种PVX-AV2和PVX-BV1植株的新生叶分别在第10天和第13天出现坏死症状,逐渐枯萎死掉,接种PVX-AC4的植株在第8天出现明显的花叶表型,而PVX-AC2和PVX-BC1及其所有基因的相应突变体在系统叶上只出现了轻微的花叶和曲叶症状,与单独接种PVX表现的症状相似。取系统叶片提取RNA,以PVX的CP基因为探针, Northern blotting结果显示,接种PVX-AV2的植株体内PVX的复制量较对照植株多,而表达NSP植株的PVX积累量没有明显变化。结果说明AV2和BV1编码的蛋白在RaMoV侵染寄主的过程中发挥重要的作用,可能是病毒能够顺利“逃脱”寄主防卫系统的关键因子,从而使病毒在寄主体内顺利进行系统侵染。激光共聚焦显微镜观察RaMoV DNA-B组分编码的蛋白的亚细胞定位情况,发现BV1编码的NSP定位在细胞核中,而BC1编码的MP主要定位在细胞质中。利用酵母双杂交技术研究了RaMoV的NSP和中国大青黄色花叶病毒（Clerodendrum yellow mosaic China virus,ClYMCNV）的NSP与寄主本氏烟1 , 5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亚基（ Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxylase small subunit, RBCS1）的互作关系。提取本氏烟的总RNA,进行RT-PCR,克隆RBCS1基因,将RBCS1与BV1分别构建到酵母表达载体pGAD-T7和pGBK-T7获得重组载体pGAD-RBCS1和pGBK-BV1,将质粒pGAD-RBCS1和pGBK-BV1共转化到酵母菌AH109,通过不同的营养缺陷型培养基进行筛选,研究两者间的互作关系。结果表明RaMoV和ClYMCNV的NSP都可以与本氏烟RBCS1互作。双分子荧光互补实验表明,NSP与本氏烟RBCS1的互作主要发生在烟草叶片细胞的细胞核里。Real time PCR检测表明,RaMoV侵染本氏烟能够使RBCS1的表达量下调55%左右。借助于pTRV诱导的沉默技术,将RBCS1基因沉默后接种RaMoV的侵染性克隆。提取基因组DNA,Southern blotting显示沉默RBCS1后,RaMoV的复制量明显增加。经DNA电泳,可在2700bp处看到一清晰条带,经测序分析后确定为RaMoV的病毒基因组,而对照的植物中没有出现这一大小的条带,说明RBCS1在病毒侵染过程中发挥重要的作用。为研究沉默RBCS1后,其它病毒侵染本氏烟的情况,接种PVX-GFP 12天后,手提式紫外灯照射显示,接种叶和系统叶的GFP表达量要比对照植株中明显增多,杂交结果表明,沉默RBCS1植株的PVX复制量比对照植株中PVX复制量增多。这些结果说明,RBCS1可能在病毒的防卫反应系统中发挥重要作用。