整体调控子PhoP直接调控鼠疫耶尔森氏菌胞内生存能力的研究

论文摘要

鼠疫是一种古老的自然疫源性疾病，是由鼠疫耶尔森氏菌（以下简称鼠疫菌）引起的。机体感染早期，鼠疫菌能在巨噬细胞内存活并繁殖，是鼠疫菌致病的关键阶段。PhoP-PhoQ是一种二元调控系统（two-component system），它可以调控细菌的毒力，参与细菌对Mg2+限制性生长环境的适应，而且还可以调节几种革兰氏阴性细菌的许多细胞活性。研究发现△phoP突变株对小鼠J774巨噬细胞感染力下降，对巨噬细胞杀（抑）菌机制（酸胁迫、过氧化氢刺激、高渗胁迫、抗菌肽作用）敏感性大大增强。虽然毒力和生化表型实验证明了PhoP-PhoQ控制着鼠疫菌胞内寄生能力，但是PhoP-PhoQ如何控制这个过程的机制至今尚未阐明。 本研究首先利用基于Red系统的一步法突变技术缺失替换鼠疫菌的phoP基因，进而利用鼠疫菌全基因组DNA芯片进行基因转录调控研究。通过比较△phoP突变株和野生株在低镁条件下的转录水平差异，界定表达上调和下调的基因，这些基因组成了PhoP调控元，这一分析可从全基因组水平筛选出所有受PhoP-PhoQ直接或间接调控的靶基因。然后，利用经典分子生化实验和生物信息学分析，深入探究二元调控系统PhoP-PhoQ转录调控的分子机制。 用凝胶迁移实验明确46个操纵子／基因直接受PhoP的转录调控。这些基因有的受PhoP的上调，有的受其下调，包括PhoP调控的各方面功能的基因。PhoP正调控mgtCB，后者可以调节Mg2+的转运；通过调节氧化应激基因、分子伴侣和ATP-依赖性蛋白酶基因以及其他应激基因来参与菌体的应激防御机制；通过正调控glgPACXB操纵子来参与恢复高渗条件下细胞浆的体积、正调控pmrHFIJKLM和ugd基因来实现脂质A的氨基阿拉伯糖修饰、调控代谢相关基因来参与鼠疫菌能量代谢、大分子和小分子的降解以及氨基酸、嘌呤、嘧啶、核苷酸、辅基和脂肪酸生物合成等。值得注意的是，鼠疫菌的PhoP能对包括其自身在内的八个调节基因，phoP、crp、lacI、phoB、cyaA、ntrB、slyA和glnK，进行直接调控从而发挥更大的级联作用。因此，二元调控系统PhoP-PhoQ应当是鼠疫菌的一个整体调控子。 为了明确PhoP的精细调控机制，本研究对26个凝胶迁移实验阳性的基因的启动子进行了足迹实验，得到了25个PhoP结合保护区域，在这个区域内存在着PhoP box，PhoP蛋白调控靶基因主要是通过结合各靶基因启动子内的PhoP box，调控各基因的转录。用motif sampler软件对这25个结合保护区域进行同源比对，并从统计学角度分析了18个位置上的碱基分布情况，最终将鼠疫菌的PhoP box归纳为（T／G）（A／G）TTTA（A／T）七核苷酸同向重复序列。但PhoP box存在

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• ABSTRACT
• 1.前言
• 1.1 古老的烈性自然疫源性疾病——鼠疫
• 1.2 鼠疫菌病原学特性
• 1.3 PhoP-PhoQ控制感染早期阶段鼠疫菌在巨噬细胞内的寄生能力
• 1.3.1 鼠疫菌的胞内寄生能力
• 1.3.2 鼠疫菌的抗菌肽抗性
• 1.3.3 PhoP-PhoQ控制着鼠疫菌的胞内寄生能力
• 1.4 本研究的目的
• 2.材料
• 2.1 菌株,质粒
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 质粒
• 2.2 酶,试剂盒
• 2.3 试剂,溶液,药品
• 2.4 主要仪器
• 3.方法
• 3.1 △phoP突变株的构建
• 3.1.1 突变盒引物的设计与突变盒的扩增
• 3.1.2 感受态细胞制备
• 3.1.3 电转化
• 3.1.4 重组克隆的筛选鉴定
• 3.2 鼠疫菌总RNA的提取
• 3.2.1 菌体收集和RNA固定
• 3.2.2 菌体裂解
• 3.2.3 沉淀核酸
• 3.2.4 消化DNA
• 3.2.5 沉淀RNA
• 3.3 总RNA的荧光素标记
• 3.3.1 逆转录生成氨基标记的cDNA
• 3.3.2 氨基标记cDNA纯化
• 3.3.3 氨基标记cDNA的荧光素标记与纯化
• 3.4 芯片杂交及数据分析
• 3.4.1 芯片的紫外交联与醛基封闭
• 3.4.2 芯片的预杂交
• 3.4.3 芯片杂交与漂洗
• 3.4.4 数据分析
• 2）分析及PhoP调控元分析'>3.5 低镁刺激元（10μM MgCl₂）分析及PhoP调控元分析
• 2）分析'>3.5.1 低镁刺激元（10μM MgCl₂）分析
• 3.5.2 PhoP调控元分析
• 3.6 PhoP蛋白的克隆,表达和纯化
• 3.6.1 引物设计及合成
• 3.6.2 产物的扩增与连接
• 3.6.3 连接产物转化感受态大肠杆菌BL21（DE3）
• 3.6.4 阳性克隆的挑选及目的蛋白的表达
• 3.6.5 目的蛋白的纯化
• 3.6.6 蛋白浓度的测定
• 3.7 凝胶迁移实验（electrophoretic mobility shift assays,EMSA）
• 3.7.1 目的DNA片断的合成
• 3.7.2 探针的标记
• 3.7.3 结合百分比的测定
• 3.7.4 未结合的标记物的去除
• 3.7.5 结合反应
• 3.8 DNA酶Ⅰ足迹实验（DNase Ⅰ footprinting assays）
• 3.8.1 寡核苷酸序列5’平末端标记
• 3.8.2 PCR及PCR产物的纯化
• 3.8.3 结合反应
• 3.8.4 足迹实验：
• 3.8.5 PhoP结合位点的生物信息学分析
• 3.9 引物延伸实验（primer extension assays）
• 3.9.1 与靶基因mRNA互补引物的设计
• 3.9.2 总RNA的提取
• 3.9.3 寡核苷酸探针的制备
• 3.9.4 引物延伸反应
• 3.10 测序反应
• 3.10.1 寡核苷酸引物的标记：
• 3.10.2 延伸／终止反应
• 4.结果
• 4.1 △phoP突变株的构建
• 4.2 PhoP调控子的转录谱分析
• 4.2.1 低镁刺激元研究
• 4.2.2 PhoP调控元研究
• 4.3 PhoP蛋白的表达纯化
• 4.4 分子生化实验
• 4.4.1 凝胶迁移实验（EMSA）
• 4.4.2 DNA酶Ⅰ足迹实验
• 4.4.3 引物延伸实验
• 5.讨论
• 5.1 鼠疫菌的新整体调控子——PhoP转录调控蛋白
• 5.1.1 调节镁离子转运
• 5.1.2 应激保护作用的调节
• 5.1.3 重塑肽聚糖和修饰脂多糖（LPS）
• 5.1.4 PhoP对细胞代谢过程的影响
• 5.1.5 广泛调控作用
• 5.2 PhoP结合位点
• 5.3 PhoP-PhoQ调控鼠疫菌的胞内寄生能力
• 5.3.1 抵抗吞噬溶酶体的低pH环境
• 5.3.2 保持菌体镁环境的自稳态
• 5.3.3 保护菌体蛋白和DNA免受损伤
• 5.3.4 抗菌肽抗性
• 6.结语
• 参考文献
• 二元调控系统PHOP-PHOQ在细菌中的调控作用
• 致谢