玻璃化冻存小鼠脑细胞的研究

论文摘要

本文以成年ICR小鼠为实验材料,进行玻璃化冻存小鼠脑细胞的研究。实验主要分为两部分:一方面检测预平衡时间和温度对脑细胞存活率的影响,分析两组玻璃化溶液（VSi, i=16和VSx, x=ae）对细胞的毒性,得出合适的预平衡时间和温度;另一方面检测冻存后小鼠脑细胞的回收率、存活率、SDH酶活性,观察细胞膜完整性,筛选出适合小鼠脑细胞玻璃化冻存的玻璃化溶液。预平衡时间和温度的选择:经过对预平衡后洗脱的细胞的存活率的检测,发现细胞的存活率随预平衡处理时间的延长而逐渐减小,其中2 min组和4 min组之间的差异不显著（P>0.05）,因而选择4 min为最佳预平衡时间。在预平衡温度筛选实验中,细胞存活率较高的是0℃,即0℃为最佳预平衡温度。玻璃化溶液的筛选:通过对冻存后细胞的回收率、存活率、SDH活性的检测,分析认为玻璃化溶液VS2和VSb对小鼠脑细胞的冻存效果较好,其组成分分别为:VS2:12%EG、16%DMSO、14%乙酰胺、6%丙三醇、0.7 M的蔗糖和6%聚乙二醇;VSb:14%DMSO、16%乙酰胺、0.15 M海藻糖和2%聚乙二醇。玻璃化冻存对细胞活性的影响:检测冻存后脑细胞的回收率,发现回收率随冻存时间的延长而减少,但减少幅度较小。SDH活性在冻存的前20 d中下降程度明显,20 d以后下降幅度变小,20 d组和30 d组没有显著差异（P>0.05）。冻存时间的延长影响细胞膜的完整性,时间越长,细胞膜受损程度越严重。玻璃化冻存过程中,由于保护剂的毒性、降温-复温过程和冻存液的洗脱等因素会对细胞的结构与功能造成一定的影响,但从文中可以看到细胞仍然保持较高的活性,表明该技术对小鼠脑细胞的长期低温保存具有一定的实际应用意义,并为大体积组织器官的长期冷冻保存提供了理论和实验依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 玻璃化冻存原理
• 1.2 玻璃化冷冻保存方法
• 1.2.1 细管法
• 1.2.2 开放式拉管法（Open Pulled Straw, OPS 法）
• 1.2.3 微滴法和固体表面法（Solid Surface of Vitrification, SSV 法）
• 1.2.4 冷环玻璃化法（Cryo-loop of Vitrification, CLV 法）
• 1.2.5 其他方法
• 1.3 玻璃化冷冻保护剂
• 1.3.1 渗透型保护剂
• 1.3.2 非渗透型保护剂
• 1.3.3 海藻糖（trehalose）
• 1.3.4 抗冻蛋白（antifreeze protein, AFP）
• 1.4 玻璃化冻存在动物组织细胞中的应用
• 1.4.1 小鼠胰岛
• 1.4.2 小鼠卵母细胞
• 1.4.3 大鼠卵巢
• 1.4.4 牛胚泡
• 1.4.5 牛卵母细胞
• 1.4.6 羊胚胎
• 1.4.7 猪胚胎
• 1.4.8 人卵母细胞
• 1.4.9 人胚胎
• 1.5 玻璃化冷冻技术的展望
• 1.6 本文的立题依据、目的及要解决的问题
• 2 材料与方法
• 2.1 实验动物、试剂与仪器
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 主要试剂与仪器
• 2.2 细胞的玻璃化溶液的配方设计
• 2.3 脑细胞悬液的制备
• 2.4 预平衡、冻存、复温和洗脱
• 2.4.1 预平衡
• 2.4.2 玻璃化冻存
• 2.4.3 复温和冻存液的洗脱
• 2.5 预平衡温度与时间对小鼠脑细胞的影响
• 2.6 玻璃化冻存后小鼠脑细胞活性和各项生化指标的检测
• 2.6.1 检测脑细胞回收率和存活率
• 2.6.2 MTT 法检测脑细胞琥珀酸脱氢酶（SDH）活性
• 2.6.3 吖啶橙荧光染色（acridine orange staining method）观察细胞完整性
• 2.7 统计学处理
• 3 实验结果
• 3.1 预平衡温度与时间对细胞的影响
• 3.1.1 不含海藻糖组玻璃化溶液对小鼠脑细胞存活率的影响
• 3.1.2 海藻糖组玻璃化溶液对小鼠脑细胞存活率的影响
• 3.2 玻璃化冻存对小鼠脑细胞的影响
• 3.2.1 玻璃化冻存对细胞回收率的影响
• 3.2.2 玻璃化冻存对细胞存活率的影响
• 3.2.3 玻璃化冻存对细胞内琥珀酸脱氢酶（SDH）活性的影响
• 3.2.4 玻璃化冻存对细胞膜完整性的影响
• 3.3 结论
• 4 讨论
• 4.1 玻璃化保护剂的筛选
• 4.2 预平衡时间与温度对玻璃化冻存效果的影响
• 4.3 玻璃化冻存对细胞酶活力的影响
• 4.4 玻璃化冻存对细胞膜的影响
• 4.5 研究展望
• 参考文献
• 个人简介
• 致谢