脂筏对GABA_B受体的调控机制研究和GABA_B受体活性荧光探针开发

论文摘要

脂筏作为细胞膜上信号传导的平台目前受到越来越多的关注,尤其是大量的研究已经显示脂筏对G蛋白偶联受体功能具有重要的调节作用。前期的研究已经发现与G蛋白偶联的GABAB受体定位之脂筏结构中,所以探究脂筏对GABAB受体的影响对揭示GABAB受体的调控机制具有新的启示作用。在本研究中,运用单点追踪技术追踪在异源HEK293细胞中实时追踪GABAB受体在细胞膜上扩散运动,发现GABAB受体的扩散特性主要由GABAB2亚基决定。更进一步的,蔗糖密度梯度分析受体在脂筏中的定位显示GABAB2亚基对受体扩散特性的决定作用取决于该亚基对受体在脂筏中定位的主导作用。因此,脂筏对限制GABAB受体的侧向扩散具有关键的作用。但是,GABAB受体同脂筏的偶联并不是固定不变的。在HEK293细胞中,激动剂GABA能显著的提高GABAB受体的扩散系数,这与采用甲基-β-环糊精（Methyl-β-cyclodextrin,MCD）破坏脂筏的效应相似。与受体扩散特性的变化相对应,共聚焦成像观测受体定位和蔗糖密度离心分析GABAB的梯度分布显示,在异源细胞和神经元细胞中GABAB受体激活之后在脂筏中的定位程度显著下降。所有结果共同说明激活GABAB受体会诱导受体转移出脂筏区域。随着GABAB受体脂筏中定位程度的降低,受体所介导的G蛋白依赖的信号通路激活强度被削弱,例如下游Gi/o介导的ERK（Extracellular signal-regulated proteinkinases）磷酸化程度降低和Gqi9融合蛋白介导的IP3（Inositol-1,4,5-trisphosphate）的产量减少,这些结果突显了脂筏正向促进GABAB受体介导的G蛋白信号通路的重要作用。另外,脂筏还能协助调控参与GABAB受体信号网络的信号分子的时空组织。信号分子随着活性的改变进入或者离开脂筏区域,从而决定了信号传递动态的启动和关闭。我们的研究掀开了从脂筏的角度诠释GABAB受体在细胞膜上动态行为和信号转导的新视野,GABAB受体的这种定位特性非常值得重视。为了在活细胞中直接观测GABAB受体在细胞膜上的活性和功能并且直接在活细胞中标记GABAB受体,基于GABAB受体高亲和力的拮抗剂CGP64213的结构,本研究设计、合成并全面评价了一种活性导向的特异性标记细胞膜上GABAB受体的小分子荧光探针即探针1。探针1由三个功能基团构成,即靶向定位基团、光亲和基团、荧光标记基团。探针可以用于光亲和性的标记在CHO细胞中瞬时表达的GABAB受体。此外,探针能够特异性的识别GABAB1亚基的配体结合口袋并表现出高效的光亲和性质,这使得探针对于在活细胞中研究GABAB受体的定位和功能上具有重要应用价值。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 绪论
• BR研究现状'>1.1 代谢型GABA_BR研究现状
• 1.2 脂筏对膜蛋白的调控
• 1.3 研究的主要内容
• 2 实验原理和研究方法
• 2.1 全内反射荧光成像
• 2.2 激光共聚焦成像
• 2.3 单点示踪技术
• 2.4 脂筏研究常见方法
• 2.5 基于SNAP标记的时间分辨荧光共振能量转移
• 3H-IP₃产量测量法'>2.6³H-IP₃产量测量法
• 2.7 免疫细胞化学技术
• B受体在细胞膜上活性的调控机制研究'>3 脂筏对GABA_B受体在细胞膜上活性的调控机制研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.3 结果与分析
• 3.4 讨论
• B受体活性荧光探针开发'>4 GABA_B受体活性荧光探针开发
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.3 结果与分析
• 4.4 讨论
• 5 总结
• 5.1 主要的研究成果
• 5.2 本研究的创新之处
• 5.3 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录1 攻读学位期间发表的论文目录
• 附录2 主要符号和缩略词表