一种新型蛋白激酶信号转导系统的初步研究

论文摘要

鱼腥蓝细菌PCC 7120（Anabaena sp. Strain PCC 7120）是一种丝状体革兰氏阴性细菌，该菌可以在缺乏化合态氮源的条件下分化形成行使生物固氮功能的异形胞。基因组数据分析表明该菌的基因组含有13个新型的蛋白激酶编码基因，这类新型蛋白激酶的特点是：氨基端具有一个丝氨酸＼苏氨酸蛋白激酶保守结构域；羧基端具有一个组氨酸蛋白激酶保守结构域，在两个保守结构域之间还具有GAF或PAS保守结构域。到目前为止，这类蛋白激酶的功能还未知。本课题的目的是通过研究此类新型蛋白激酶的功能揭示这类新型的信号转导机制。本课题主要研究其中的两个基因pkn41（alr0709）和pkn42（alt0710）的功能。RNADot Blot和RT-PCR实验证实这两个基因的转录受缺铁的诱导，而且与培养基中氮源的性质无关。这两个基因的ORF之间只有72 bp的间隔，RT-PCR实验结果证实它们在缺铁条件下表现出共转录的特点。pkn41和pkn42基因的插入失活单突变体和基因敲除双突变体表型分析显示：在正常条件下，突变体的生长与野生型没有明显的差异，但是在有铁螯合剂存在或者同时缺铁缺氮的条件下，突变体的生长相对于野生型明显地被抑制。细胞内铁含量测定结果显示突变体细胞内铁含量明显低于野生型细胞，同时细胞在缺铁条件下的色素蛋白含量测定结果也表明突变体细胞色素蛋白的含量低于野生型细胞，而且突变体细胞在缺铁条件下的过氧化氢酶活性明显高于野生型细胞。以上突变体表型分析结果表明pkn41和pkn42参与细胞内的铁代谢调控。突变体表型分析和突变体互补实验结果也很好地表明pkn41和pkn42基因具有共转录的特点。受缺铁诱导的基因nifJ和nifJ-like在pkn41和pkn42基因单突变体中表现出很高的诱导表达，并且与培养基中是否缺铁无关，这表明pkn41和pkn42基因参与对nifJ和nifJ-like的调控或它们的缺失造成细胞内缺铁而诱导nifJ和nifJ-like基因的表达。以上的结果表明pkn41和pkn42基因参与细胞对缺铁的适应性调节。pkn41基因的ATG上游具有一个保守的NtcA蛋白结合位点GTA-Na-TAC，EMSA体外实验证明NtcA蛋白可以结合到pkn41基因的启动子区域。同时RT-PCR和Real-time PCR结果证明pkn41和pkn42基因在缺铁条件下的诱导表达可以被ntcA基因突变体抑制，这些结果表明NtcA蛋白确实参与了对pkn41和Ipkn42基因的表达调控。NtcA蛋白对pkn41和pkn42基因的调控表明NtcA蛋白不仅参与对细胞氮代谢和碳代谢的调控而且参与细胞对缺铁环境的适应。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1.文献综述
• 1.1 鱼腥监细菌PCC 7120的氮代谢和缺氮胁迫
• 1.1.1 鱼腥蓝细菌PCC 7120的特点
• 1.1.2 鱼腥蓝细菌PCC 7120的氮代谢和氮胁迫
• 1.2 NtcA蛋白的调控作用
• 1.2.1 异形胞发育信号分子的可能受体—NtcA蛋白
• 1.2.2 NtcA蛋白的特点
• 1.2.3 NtcA蛋白对目标基因的调控作刚
• 1.2.4 ntcA基冈与herR基因之间的相互作用
• 1.3 蛋白激酶信号转导系统
• 1.3.1 真核类蛋白激酶系统
• 1.3.2 双组分蛋白激酶系统
• 1.3.3 真核类蛋白激酶系统与双组分蛋白激酶系统的偶联
• 1.3.4 一种新型蛋白激酶信号转导系统
• 1.4 铁代谢
• 1.4.1 细胞对铁的吸收和转运
• 1.4.2 细胞对铁的储存
• 1.4.3 铁胁迫
• 1.5 氧化胁迫
• 1.5.1 过氧化物歧化酶和过氧化氢酶
• 1.5.2 氧化胁迫转录调控子
• 1.5.3 蓝细菌氧化胁迫适应系统
• 1.6 研究的目的和意义
• 2. 材料和方法
• 2.1 菌株和质粒
• 2.2 培养基配方以及培养条件
• 2.3 常用贮存液和缓冲液配方
• 2.3.1 贮存液
• 2.3.2 缓冲液
• 2.4 主要的分子生物学试剂
• 2.5 实验方法
• 2.5.1 鱼腥蓝细菌PCC 7120总DNA的抽提
• 2.5.2 质粒DNA的制备及其基本操作
• 2.5.3 转化
• 2.5.4 鱼腥蓝细菌PCC 7120中蛋白质的制备和定量
• 2.5.5 Western Blotting
• 2.5.6 蛋白质的表达和蛋白质的纯化
• 2.5.7 细胞内铁含量的测定
• 2.5.8 RNA的提取和纯化
• 2.5.9 二维电泳实验
• 3.结果与分析
• 3.1 pkn41和pkn42基因的结构
• 3.2 RNA DotBlot和RT-PCR验证pkn41和pkn42基因的表达
• 3.2.1 RNA Dot Blot验证pkn41和pkn42基因的表达
• 3.2.2 RT-PCR验证pkn41和pkn42基因的表达
• 3.2.3 Ppkn41-gfP融合表达质粒的构建
• 3.2.4 pkn41和pkn42基因在缺铁条件下共转录
• 3.3 pkn41和pkn42基因单突变体的构建
• 3.3.1 鱼腥蓝细菌PCC 7120pkn41基因单突变体的构建
• 3.3.2 鱼腥蓝细菌PCC 7120pkn42基因单突变体的构建
• 3.3.3 突变体菌株的鉴定（Southern Blot）
• 3.4 pkn41和pkn42基因双突变体的构建
• 3.4.1 双突变体的构建
• 3.4.2 酶切验证质粒pRLDMl2Ω
• 3.4.3 突变体菌株的验证
• 3.5 pkn41和pkn42基因突变体表型分析
• 3.5.1 突变体生长曲线分析
• 3.5.2 突变体菌株对铁螯合剂2,2-dipyridyl的敏感性
• 3.5.3 RT-PCR验证突变体菌株的表型
• 3.5.4 ICD酶活的测定
• 3.5.5 突变体细胞内过氧化氢酶活性的测定
• 3.5.6 突变体细胞内铁含量的测定
• 3.5.7 培养基中Siderophore活性的测定
• 3.5.8 突变体细胞色素蛋白含量的测定
• 3.6 突变体互补实验
• 3.6.1 质粒的构建
• 3.6.2 三亲本杂交
• 3.6.3 突变体互补菌株的验证
• 3.6.4 突变体互补菌株表型分析
• 3.7 重组NtcA蛋白的诱导和纯化
• 3.7.1 确定在大肠杆菌中重组NtcA蛋白的最佳诱导时间
• 3.7.2 重组NtcA蛋白的诱导
• 3.7.3 重组NtcA蛋白的纯化
• 3.8 EMSA实验体外验证NtcA蛋白与pkn41基因启动子间的相互作用
• 3.8.1 利用PCR技术体外扩增pkn41和glnA基因的启动子区段
• 3.8.2 大肠杆菌细胞提取液与DNA片段之间的相互作用
• 3.8.3 纯化重组NtcA蛋白与pkn41基因启动子区域的相互作用
• 3.8.4 放射性同位素标记的pkn41基因启动子DNA片段与NtcA蛋白的相互作用
• 3.9 检测pkn41和pkn42基因在ntcA突变体中的表达
• 3.9.1 RT-PCR验证pkn41和pkn42基因在ntcA突变体中表达
• 3.9.2 Real-time PCR验证pkn41和pkn42基因在ntcA突变体中表达
• 3.10 二维电泳分析突变体菌株和野生型菌株基因在缺铁条件下的差异性表达
• 3.11 Western Blot验证NtcA蛋白在不同条件下的表达
• 4.0 讨论与总结
• 参考文献
• 致谢