耐盐相关基因HAL1的作物转化研究

论文摘要

盐碱地是巨大的潜在资源,绿化盐碱地是扩大耕地面积,进一步发展农业生产和改善生态环境的重要措施。而培育耐盐抗旱作物新品种是利用盐碱地的一条经济而有效的途径。到目前为止,利用常规方法尚未培育出真正的耐盐抗旱品种。随着植物耐盐抗旱分子机制研究的不断深入和转基因技术的不断完善,利用基因工程手段培育高效耐盐抗旱作物新品种有了新的希望。研究表明,对盐胁迫最适应的基因型具有协调离子跨膜吸收与液泡分隔作用,因此分离与离子跨膜转运、离子分隔相关的关键基因并对其表达产物的功能进行分析显得尤为必要。HAL1基因是酿酒酵母中与耐盐相关的基因,其直接的保护性机制是能够调节细胞内离子均衡;该基因能在盐胁迫下表达,产物为定位于细胞质中的32 KD的蛋白,具有调节Na+/K+比的作用;虽然HAL1本身不是转运蛋白,但它在酵母体内能与ENA1基因协同作用促进Na+外排,与其他转运系统协同作用增加K+的吸收,使细胞内保持较低的Na+/K+比,从而减轻了Na+对细胞的毒害作用,因而在植物耐盐基因工程育种上具有很大的应用潜力。本研究用农杆菌介导的叶盘法将HAL1基因转入模式植物烟草,探索了农杆菌介导的烟草遗传转化条件及其影响因素,并对转基因烟草的耐盐性进行了评价。主要研究内容及结果如下:实验探讨了根癌农杆菌生长的培养基类型、细菌生长状态、转化溶液种类及浓度、质粒DNA用量、液氮处理时间等因素对感受态细胞制备和转化效率的影响,建立起了一个高效快速的农杆菌冻融法转化体系,并用该体系转化得到含有重组质粒pROKⅡ/HAL1的农杆菌菌株LBA4404和C58C1。结果表明,以浓度为70mmo/LCaCl2为转化溶液,以OD600值为0.5-0.6的菌液为受体细胞,用YEB液体培养基制备的感受态细胞转化效果最佳。100ulLBA4404感受态细胞和10ng质粒DNA于0℃共放置30min,液氮速冻5min,37℃热激5min转化率高达1.4×105转化子/ugDNA;100ul C58C1感受态细胞和20ng质粒DNA共放置10min,液氮速冻1min,37℃热激1min转化率最高,可达1.33×105转化子/ugDNA。研究了秦选1号和秦烟95烟草叶片的耐卡那霉素水平,为转基因株系的选择提供有效依据。卡那霉素浓度梯度筛选试验表明,分别以20mg/L和30mg/L卡那霉素作为秦选1号和秦烟95在农杆菌转化后抗性芽的筛选浓度为宜;以20mg/L卡那霉素作为转化植株生根时的筛选浓度为宜。为了提高烤烟品种秦选1号和秦烟95的耐盐水平,实验采用农杆菌介导的叶圆盘

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 重组 DNA 导入受体菌研究现状
• 1.1.1 重组DNA 转化方法
• 1.1.2 转化子的筛选与鉴定
• 1.2 植物遗传转化研究进展
• 1.2.1 遗传转化的受体系统
• 1.2.2 遗传转化方法
• 1.2.3 烟草遗传转化研究进展
• 1.2.4 小麦遗传转化研究进展
• 1.3 植物耐盐基因工程研究进展
• 1.3.1 植物耐盐基因工程研究意义
• 1.3.2 植物耐盐机理
• 1.3.3 耐盐相关基因的研究及其应用
• 1.3.4 HAL1 基因研究进展
• 1.4 本项研究的目的和意义
• 第二章 重组质粒导入根癌农杆菌的冻融法转化体系的优化
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 根癌农杆菌感受态细胞的制备
• 2.1.3 转化方法
• 2.1.4 根癌农杆菌质粒 DNA 的提取
• 2.1.5 转化子中目的基因的PCR 检测
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 培养基类型对感受态细胞制备及转化效率的影响
• 2.2.2 根癌农杆菌菌株生长状态对感受态细胞转化率的影响
• 2.2.3 转化溶液组成及浓度对转化效率的影响
• 2.2.4 质粒 DNA 与感受态细胞共放置时间对转化效率的影响
• 2.2.5 质粒 DNA 加入量对转化效率的影响
• 2.2.6 液氮速冻时间及热激条件对转化效率的影响
• 2.2.7 转化子中目的基因的PCR 检测
• 2.3 讨论
• 第三章 根癌农杆菌介导的 HAL1 基因转化烟草的研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 烟草叶片愈伤组织诱导和分化芽过程中Kan 筛选浓度的确定
• 3.2.2 生根过程中Kan 筛选浓度的确定
• 3.2.3 抑菌过程中抗生素浓度的确定
• 3.2.4 根癌农杆菌介导的烟草遗传转化体系的优化
• 3.2.5 转化植株的获得
• 3.2.6 转化植株的PCR 检测
• 3.3 讨论
• 第四章 转 HAL1 基因烟草的耐盐性研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 未转化烟草生根能力评价
• 4.2.2 转基因烟草生根能力评价
• 4.3 讨论
• 第五章 利用花粉管通道法将耐盐调空基因 HAL1 导入小麦的研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 花粉管通道法转化小麦当代结实及种子萌发情况
• 5.2.2 卡那霉素筛选浓度的确定
• 5.2.3 筛选结果
• 5.2.4 转化植株的分子检测
• 5.2.5 转化植株的生长发育状况
• 5.3 讨论
• 第六章 利用基因枪法将耐盐调控基因 HAL1 导入小麦的研究
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 供试材料
• 6.1.2 高渗处理和基因枪转化
• 6.1.3 恢复培养、筛选及植株再生
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 普通小麦基因枪转化高效受体系统的建立
• 6.2.2 基因枪法转化小麦幼胚愈伤组织的筛选程序和植株再生
• 6.3 讨论
• 第七章 转 HAL1 基因小麦植株的获得
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 材料
• 7.1.2 基因组DNA 的提取
• 7.1.3 PCR 扩增
• 7.1.4 小麦叶片总RNA 的提取、定量及纯化
• 7.1.5 RT-PCT 检测
• 7.1.6 探针标记
• 7.1.7 Northern 印迹杂交
• 7.2 结果与分析
• 0 代植株的PCR 检测'>7.2.1 转基因T₀ 代植株的PCR 检测
• 0 代植株的RT—PCR 检测'>7.2.2 转基因T₀ 代植株的RT—PCR 检测
• 0 代植株的Northern 检测'>7.2.3 转基因T₀ 代植株的Northern 检测
• 7.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 英文缩写词表
• 致谢
• 作者简介