产木聚糖酶放线菌的分离、筛选与多相分类研究

论文摘要

木聚糖是以木吡喃糖为单位的由β—1,4键连接的半纤维素,富含于阔叶树和大多数一年生植物体内,在自然界中含量占生物量的30%,是一种重要的可再生资源。木聚糖酶（1,4-β-D-xylanxylanohydrolase, EC.3.2.18）是一类木聚糖降解酶系,属于水解酶类,包括内切—β-1,4—木聚糖酶、外切β—木聚糖酶和β—木二糖苷酶。本研究仅限于内切—β-1,4—木聚糖酶。本研究开展了菌种分离、酶活筛选、菌种分类研究工作,发现了能够产生木聚糖酶的新的放线菌资源。以云南西双版纳、泰国、老挝等地的森林土和新疆、青海牧区草甸土壤样品为主要分离基物,以木聚糖为主要碳源,选择不同的氮源,补充必要的镁离子、钾离子、钙离子、磷元素、维生素、必需的微量、半微量元素,添加选择性抑制剂,设计配制16种分离培养基,采用4种土样预处理办法,用稀释涂布平板法,分离得到放线菌691株。其中稀有放线菌429株,占放线菌菌株的62.1%。采用Megazyme公司生产的Azo-wheat arabinoxylan为底物,对691株分离菌株进行木聚糖酶活性测试筛选。初筛得到酶活高于10IU/ml的木聚糖酶产生菌113株,其中典型链霉菌形态的放线菌93株,稀有放线菌20株。对113株木聚糖酶阳性菌株进行复筛,结果发现1株链霉菌菌株I09A-00123的木聚糖酶活性明显高于其他菌株。对菌株I09A-00123的产酶条件和酶活测定条件进行了初步优化。该菌株产生木聚糖酶最适反应温度为55℃,最适pH为6.5。在40℃以下保温30min后酶活保持大于98%,在55℃保温30min后酶活保持58%,在70℃保温30min后酶活仅保持13%。以木聚糖作为碳源、硝酸铵作为氮源、在pH 6.5、28℃条件下发酵60h时酶液活性最高。菌株的16S rRNA基因分析显示,本实验筛选得到的具有木聚糖酶活性的放线菌菌株分属于链霉菌属（Streptomyces）、小单胞属（Micromonospora）、马杜拉放线菌属（Actinomadura）、拟无枝菌酸菌属（Amycolatopsis）、假诺卡氏菌属（Pseudonocardia）、节杆菌属（Arthrobacter）、柠檬球菌属（Citricoccus）、壤霉菌属（Agromyces）和放线多孢菌属（Actinopolyspora）。在相关文献报道中尚未检索到有关拟无枝菌酸菌属和放线多孢菌属的菌株产生木聚糖酶的研究。本研究拓展了对木聚糖产生菌的研究范围。根据菌株形态特征及16S rRNA基因序列分析结果,选定5株能产生木聚糖酶的稀有放线菌进行多相分类研究。综合形态特征、生理生化实验、细胞化学分析、分子分类研究结果,确定2株为放线菌新物种。其中菌株CPCC 202699T是拟无枝菌酸菌属（Amycolatopsis）的一个新种。菌株来源于以木聚糖为主要碳源的分离培养基上,因此,命名为Amycolatopsis xylanica sp. nov.。详细的分类研究结果已经在IJSEM杂志online发表。菌株CPCC 202695T是壤霉菌属（Agromyces）的一个新种,在供试培养基上的菌落呈黄色,所以,将该新种命名为Agromyces flavus sp.nov.。相关研究结果已经投稿于IJSEM。另外1株放线菌属于柠檬球菌属（Citricoccus）,其余2株放线菌属于马杜拉放线菌属（Actinomadura）,其种级分类地位有待于与相应近源菌株杂交后进一步确定。本研究把木聚糖酶活性筛选和放线菌的分类研究相结合,首次发现了能够产生木聚糖酶的放线菌新类群,扩充了放线菌资源的应用研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章 产木聚糖酶的放线菌菌株的分离
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 土壤样品
• 1.1.2 培养基
• 1.2 方法
• 1.2.1 土壤样品预处理
• 1.2.2 菌种分离、纯化和保藏
• 2 结果
• 3 本章小结
• 第二章 产木聚糖酶的放线菌菌株的筛选、产酶条件与酶活测定条件的优化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 主要化学试剂及仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 酶活测定方法
• 1.2.2 筛选方法
• 1.2.3 高产菌株产生的木聚糖酶活测定条件与产酶条件优化
• 2 结果
• 2.1 菌株初筛结果
• 2.2 菌株复筛结果
• 2.3 木聚糖酶高产菌株I09A-00123酶活测定条件与产酶条件优化
• 3 本章小结
• 第三章 5株产木聚糖酶的放线菌菌株的多相分类
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种来源
• 1.2 方法
• 1.2.1 菌株的形态特征和培养特征观察
• 1.2.2 菌株的16S rRNA基因序列分析
• 1.2.3 菌株生理生化特性测定
• 1.2.4 菌株细胞化学组份分析
• 1.2.5 菌株的分子分类
• 2 结果
• 2.1 形态观察结果
• 2.2 菌株的16S rRNA基因分析
• 2.2.1 5株放线菌菌株的16S rRNA基因序列测定结果
• 2.2.2 系统进化分析
• 2.3 生理生化实验结果
• 2.3.1 测试菌株的pH耐受范围、盐耐受范围及生长温度范围
• 2.3.2 测试菌株的碳源发酵产酸测定结果
• 2.3.3 测试菌株的酶学特性测定结果
• 2.3.4 测试菌株的其他生化测定结果
• 2.3.5 测试菌株的唯一氮源利用
• 2.4 测试菌株的化学组分分析结果
• 2.4.1 测试菌株的细胞壁氨基酸、全细胞水解物糖、甲基萘醌、极性脂等分析结果
• 2.5 菌株的分类研究结果
• 2.5.1 CPCC 202699T的分类研究结果
• 2.5.2 CPCC 202695T的分类研究结果
• 2.5.3 CPCC 202697的分类研究结果
• 2.5.4 CPCC 201357的分类研究结果
• 2.5.5 CPCC 100074的分类研究结果
• 3 小结
• 参考文献
• 附录1 部分培养基配方
• 附录2 脂肪酸图谱
• 附录3 已发表论文
• 文献综述
• 致谢