新生猪胰腺干细胞的分离培养与鉴定

论文摘要

随着生活水平的提高,糖尿病的患病率日益增高,已成为继心血管疾病、肿瘤之后第三大高发慢性病。快速、有效、长期地补充机体胰岛素是治疗糖尿病的根本方案。目前采用的三种补充机体胰岛素分泌不足的方法中,以移植功能胰腺干细胞的效果最好,因为干细胞增殖能力强、数量充足,移植后排斥反应低,并且机体还可根据需要,调节产生胰岛素和其他辅助细胞因子等的多种细胞比例,避免并发症发生。但是由于供体细胞的严重匮乏限制了其广泛的应用,于是人们转向寻找异种动物胰腺干细胞作为供体细胞来源。在研究中发现,新生猪胰腺干细胞可作为最佳的异种动物胰腺干细胞的供体细胞,对新生猪胰腺干细胞的研究是治疗糖尿病的新希望。本试验从新生猪胰腺干细胞分离培养、鉴定两个方面进行研究,建立新生猪胰腺干细胞的最佳分离培养和鉴定体系。1.建立新生猪胰腺细胞的分离培养体系。取新鲜的新生猪胰腺组织,经处理后操作,0.1%v型胶原酶+0.25%胰酶消化,形成小细胞团和单个细胞,过滤,低速、多次离心,或以特殊离心液离心,均可获得高活力的胰腺细胞,用成纤维细胞或多聚赖氨酸包被培养皿,以低糖DMEM培养液添加15%血清及10 mmol/L烟碱作为基础培养液,采用连续分离培养4d后,除去未贴壁细胞,更换为去除烟碱、添加10 ng/mL EGF的基础培养液,长期培养以促进胰腺细胞体外增殖生长。实验验证新生猪胰腺存在多种干细胞。2.新生猪胰腺干细胞的形态观察和鉴定。原代细胞以细胞团和单个细胞贴壁,细胞团中不断有细胞脱离、悬浮,保留的贴壁细胞和单个细胞生长,约8d出现多突起干细胞明显增多,克隆样生长,很快连接成网状;小圆细胞数量增多;多角形导管上皮干细胞增殖慢。倒置显微镜观察多突起细胞具50～80gm长突起、有极性、核质比大、细胞器不发达;小圆细胞为直径10～12μm、CK7阳性;多角形细胞呈圆形、核质比大、可见胞质内细胞器和细小分泌颗粒。本实验成功地分离到四种形态的胰腺干细胞:多角形细胞、多突起内细胞、长梭形和小圆细胞。免疫组化鉴定,分离的细胞不仅表达胰腺干细胞的标志PDX-1、CK7和nestin等,也表达胚胎干细胞标志SSEA-1、Oct3/4等,证实分离的细胞具有胰腺干细胞特征。测定新生猪胰腺干细胞的生长曲线。分离培养的胰腺干细胞体外生长10～13d可传代。成功地进行液氮冷冻保存并复苏,解冻后细胞活力在90%以上。首次采用单克隆和微环境处理相结合,证明胰腺干细胞的多样性,体外研究初步证明分离的新生猪胰腺干细胞具有受不同因子影响的增殖潜能。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 文献综述
• 第一章 胰腺干细胞的研究进展
• 1.1 干细胞和胰腺干细胞的概念
• 1.2 胰腺的发育
• 1.3 胰腺干细胞的分布
• 1.4 胰腺干细胞分子发育途径
• 1.5 胰腺干细胞的表面标志
• 1.6 胰腺和其他成体组织源干细胞的起源
• 1.7 胰腺干细胞的培养
• 1.8 胰腺干细胞的成熟和检测
• 1.9 干细胞建系标准
• 1.10 胰腺干细胞的分离培养及传代难点
• 实验部分
• 引言
• 第二章 新生猪胰腺细胞分离培养方法的建立
• 2.1 材料与方法
• 2.2 新生猪胰腺细胞的分离培养
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 新生猪胰腺细胞形态观察与干细胞鉴定
• 3.1 材料与方法
• 3.2 猪胰腺干细胞的鉴定
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 个人简介